大肠杆菌的保存与培养

1、菌种的保存 重组DNA分子（质粒、噬菌体、粘性质粒）必须导入宿主菌中， 通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系 大肠杆菌概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、 遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能 够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使 微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困 难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状 的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种 保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的 保藏之后仍然保持着原

2、有的生命力、优良生产性能、形态特征以 及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微 生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度 就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们 利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动 或不活动状态，以减少变异的发生。菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等 手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和 繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而 可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活 与繁殖能力、不发生形态特征、生理状

3、态及遗传性状的 改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的 单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入廿油或 二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。廿油低温保存法(一70C 196C)的特点1I.廿油菌低温保存的基本原理是：在-70 C或液氮中冻存，细菌内 的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 在0C-70C温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重 损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此， 为了避免0C-70C冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏， 需要加保护剂。廿油可降低冰点，在缓慢的冻结

4、条件下，能使细 菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70C以下低温中能减少 冰晶形成，廿油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细 菌.,II.使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的廿油和菌液，混匀后贮存于-70C或液氮中。复苏 后细菌仍能生长，活力不受任何影响。二、菌种的复苏复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37C 培养8-12小时即可。廿油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0C 冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可 全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。三、大肠杆菌培养培养基配

5、制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。根据有 无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培 养基。LB (Luria-Bertain)液体培养基配制精解蛋白胨(bacto-tryptone)%酵母浸出粉(bacto-extract)%氯化钠搅拌使之完全溶解，用5molNaOH1000ml培养基)调pH至，如用进口试剂可不必调，高压灭菌20min(120C含琼脂的固体培养基配制普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加琼脂制成， 先配液体培养基，然后加入琼脂，高压灭菌20min，取出后再 无菌状态下铺平板（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50C 时加抗生素或其他必加

6、成分，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。（抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶 中，氨苄青霉素终浓度50pl/ml）新制备的固体培养基较湿，铺上的 液体不易吸收，可在室温下放2-3天，或37C放半小时，然后4C 保存备用。（3）LB培养基中所用抗生素终浓度：氨苄青霉素-50pl/ml；氯 霉素-20pl/ml；庆大霉素-15pl/ml；卡那霉素-30pl/ml；春日霉素 -1000pl/ml；壮观霉素-100pl/ml；链霉素-30pl/ml；四环素-12pl/ml。 注意：除了四环素保存-20C，其余均应保存4C，所有抗生素 均应溶于无菌去离子水。四环素对光敏感液体细菌培养1）小量培养：（1）取灭菌16或18mm 口径培养管，加3-5mlLB培养基，再加 50mg/ml氨苄青霉素3-5ul （宿主菌不加抗生素）（2）无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液5-10U1，转 入培养液中，封好管口37C摇床培养100-200r/min至生长饱和，约6-12小时2）大量培养:取500ml培养瓶内装培养基100-2