脑益康对阿尔茨海默病大鼠中枢胆碱能系统酶的影响

1、脑益康对阿尔茨海默病大鼠中枢胆碱能系统酶的影响耿劲松，周爱玲，胡亚娥，朱燕，茅家慧，施海燕【摘要】目的观察中药复方脑益康对阿尔茨海默病AlzhEiersdisease,AD大鼠中枢胆碱能系统的保护作用。方法采用脑立体定位仪自双侧基底前脑eynert核nuleusbasalisfeynert,NB注射鹅膏蕈氨酸Ibteniaid,IB建立AD大鼠模型，分别给予不同剂量脑益康对AD大鼠进展治疗，测定不同组实验大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶aetylhlinesterase,AhE、丁酰胆碱酯酶butyrhlinesterase,BuhE活性及胆碱乙酰转移酶hlineaetyltransferase,hAT

2、在基底前脑的表达。结果脑益康能抑制脑组织AhE和BuhE的活性；改善基底前脑hAT阳性神经细胞形态并增加其数量。结论脑益康通过促进hAT表达，增加乙酰胆碱aetylhline,Ah的合成；通过降低脑组织AhE和BuhE的活性，抑制Ah分解；从而增加脑内Ah含量，改善AD大鼠的学习、记忆障碍。【关键词】脑益康；阿尔茨海默病；乙酰胆碱酯酶；丁酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶Abstrat：bjetiveTbservetheprtetiveeffetsfNaYikang(NYK)nentralhlinergisysteinratsithAlzheiersdisease(AD).ethdsBilateral

3、infusinsfIbteniaid(IB)intnuleusbasalisfeynert(NB)usingsteretaxiapparatusasadptedtestablishtheratdelfAD.NYKatdifferentdsagehasbeenadinisteredtADrats.Theativitiesfbrainaetylhlinesterase(AhE)andbutyrhlinesterase(BuhE)asellastherphlgyfhlineaetyltransferase(hAT)-psitiveellsinthebasalfrebraineredeteted.Re

4、sultsNYKuldinhibittheativitiesfAhEandBuhE,iprvetherphlgyandinreasethenuberfhAT-psitiveellsasell.nlusinNYKaybeabletinreasethesynthesisfaetylhline(Ah)thrughelevatingtheexpressinfhAT,inhibitthedegradatinfAhbyinhibitingtheativitiesfAhEandBuhE,thuselevatingthelevelfAhinratsbrainandiprvetheabilityflearnin

5、gandery.Keyrds：NaYikang;Alzheiersdisease;Aetylhlinesterase;Butyrhlinesterase;hlineaetyltransferase阿尔茨海默病AD是发生在老年前期或老年期，与年龄相关的神经系统退行性疾玻AD的发病机制极其复杂，病因学尚不清楚，且无特效治疗或逆转疾病进展的药物，其病理生理机制及防治研究是近年来神经科学领域的研究热点之一。祖国传统中医药理论对AD有独到的认识，认为AD属中医学“呆证“善忘等病的范畴。中药复方脑益康由制首乌、知母、石菖蒲等组成。制首乌是祖国医学中一种古老的用于延年益寿、益脑调心的药物；中药知母能显著上调

6、脑1-毒蕈碱型乙酰胆碱受体密度，且上调的幅度和改善记忆之间存在明显的正相关1；石菖蒲有改善记忆、扩张血管、降压等作用。脑益康有效成分多，药理作用广泛，可以多层次、多靶点地发挥治疗作用。本实验采用自大鼠双侧基底前脑eynet核NB注射鹅膏蕈氨酸IB建立AD动物模型，生物化学方法检测皮层乙酰胆碱酯酶AhE和丁酰胆碱酯酶BuhE活性，免疫组织化学方法观察基底前脑胆碱乙酰转移酶hAT阳性神经细胞形态，为临床应用脑益康治疗AD，促进中枢胆碱能神经功能的恢复提供充分的理论根据。1器材与方法1.1材料1.1.1动物SPF级SD雄性大鼠60只，体质量(23010)g，由南通大学实验动物中心提供，动物合格证号：

7、SYXK苏2002-0022。1.1.2药品与试剂实验所用中药复方脑益康(NaYikang，NYK)由南通市中医院制剂室制成颗粒剂，每克颗粒剂含生药1.98g；脑复康吡拉西坦片，南京白敬宇制药厂；IBSiga-Aldrih；山羊抗hAT一抗美国hein，批号：0510012059；AhE及BuhE测定试剂盒南京建成生物工程研究所；二抗免疫组化染色及DAB试剂盒北京中杉金桥生物技术。1.1.3仪器大鼠脑立体定位仪、注射泵及微量注射器美国Stelting公司；Y-型迷宫刺激器张家港市三兴教学机械厂；XHF-1高速分散器上海金达生化仪器厂；754型紫外可见分光光度计上海光谱仪器；冰冻切片机LAIA1

8、900，德国；数码相机annPerShtS60，日本。1.2方法1.2.1动物分组经Y-型迷宫刺激器挑选的正常大鼠60只，采用随机数字法分为6组。即假手术组Sha，模型组del，脑复康对照组NFK)，脑益康低、中、高剂量组NYK-L，NYK-，NYK-H。1.2.2模型的建立大鼠经10%水合氯醛4lkg-1腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪。备头部皮肤，常规消毒手术区皮肤。无菌下操作，沿颅顶中线做2.0纵行切口，止血，钝性别离骨膜。参照大鼠脑立体定位定位图谱2：AP-1.14、L3.1、DV7.7，于双侧颅骨对应点分别垂直钻一直径1的孔洞。每侧注射IB1l5gl-1，注射时间持续5in，留针5

9、in。缓慢拔针后消毒创面，骨蜡封颅骨孔，缝合头皮。假手术组取一样坐标，进针后双侧注射等量灭菌NS。待大鼠清醒后放回笼中常规饲养。1.2.3给药方案药物均溶于0.5%羧甲基纤维素钠。假手术组给予生理盐水nralsaline,NS；模型组给予溶剂；阳性药对照组给予0.40gkg-1d-1脑复康；脑益康低，中，高剂量组的药物浓度比依次为1241.73，3.45，6.90gkg-1d-1，其中，中剂量相当于临床用量。于术后第2天开场灌胃给药，给药容量均为0.1lkg-1。1次/d，连续给药28d。1.2.4脑组织AhE，BuhE活性测定断头取脑，称取皮层100g，置10l带盖塑料离心管中；迅速向管中参

10、加预冷NS1.0l；用XHF-1高速分散器1500r/in充分匀浆；4离心3500r/in，10in后取上清液。考马斯亮蓝法测定脑组织中总蛋白含量，羟胺比色法测定AhE及BuhE的活性。1.2.5基底前脑hAT免疫组织化学染色大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，常规灌注取脑。取实验所需部位脑组织于恒冷切片机中在-20下连续冰冻切片，片厚30，选取AP-0.36AP-2.64断面脑片备用。将脑片放于3%H22去离子水中孵育510in；0.01l/LPBST漂洗3次；正常兔血清工作液封闭，室温下孵育1015in，弃兔血清；滴加1:100稀释的hAT一抗，4过夜，漂洗；二抗工作液37孵育1015in

11、，漂洗；辣根酶标记链霉卵白素工作液37孵育1015in，漂洗。DAB显色、脱水、透明、封固，光镜下观察结果。hAT阳性标准：细胞浆染成棕黄色。1.3统计学处理采用SPSS11.5统计软件进展单因素方差分析，数据均以s表示。显著性检验采用单因素方差分析，两两比拟用Sheff法，以P0.05为有统计学意义。2结果2.1对AD大鼠脑组织AhE，BuhE活性的影响模型组大鼠脑组织AhE活性较假手术组显著升高P0.01；脑益康中、高剂量组大鼠脑组织AhE活性较模型组显著降低P0.01，与假手术组相比无明显差异P0.05。结果见表1。表1脑益康对AD大鼠脑组织AhE活性的影响略与假手术组比拟，模型组Buh

12、E活性显著升高P0.01；与模型组比拟，脑益康中剂量组BuhE活性明显降低P0.05。结果见表2。表2脑益康对AD大鼠脑组织BuhE活性的影响略2.2对AD大鼠基底前脑hAT表达的影响取3组大鼠脑组织，每例连续取AP-0.36AP-2.64的6张切片，在200倍光镜下记数基底前脑hAT阳性细胞数，取其平均值为每例的阳性细胞数。假手术组可见深染的hAT阳性神经元，数目较多，突触较完好；模型组神经元着色变浅、阳性细胞数目减少P0.01、胞体缩孝突触不完好甚至消失，提示模型组hAT表达减少；脑益康中、高剂量组比模型组的阳性细胞数目显著增加P0.01，突触完好性增加，hAT表达程度增加。见图1及表3。

13、表3脑益康对AD大鼠基底前脑hAT表达的影响略3讨论正常情况下，BF神经元主要位于基底核、斜角带核和内侧隔核合成大量乙酰胆碱Ah并经胆碱能投射纤维输送至大脑皮层和海马。Ah参与调节大脑的神经元活动，在突触可塑性方面起关键作用。研究说明，当大鼠承受空间及反响性训练时，纹状体和海马Ah释放增加3。Ah是记忆形成的必需神经递质和长期记忆的生理根底，Ah通过脑干网状构造上行冲动系统维持大脑觉悟状态，而大脑皮层及海马的Ah缺失引起空间认知和记忆障碍。Ah生成及生物学作用的任何环节异常，均可引起胆碱能系统功能障碍。增加Ah合成或减少Ah的分解，可改善学习、记忆才能。Ah在突触间隙被胆碱酯酶hlineste

14、rase,hE水解为胆碱和乙酸，释放出的胆碱大局部经胆碱能转运体被胆碱能神经末稍重新摄龋hE根据其水解基质的专一性和速度不同分真性AhE和假性AhE，前者又称AhE，后者包括BuhE和丙酰胆碱酯酶prpinylhlinesterase,PrhE。AhE水解中枢神经系统和副交感神经节后纤维和自主神经节前纤维冲动时所释放的Ah，以保证神经兴奋与抑制的协调统一。AhE活性升高与hAT活性下降亲密相关，且AhE程度与细胞外Ah含量有关4。AhE通过抑制突触处Ah降解，使Ah浓度增加，进步AD患者的学习、记忆才能。BartzkisG.等5研究发现，AhE通过增加少突胶质细胞的胆碱能刺激，促进髓鞘形成及修

15、复。本实验检测脑内AhE活性显示，模型组大鼠胆碱能神经元受损后，脑组织AhE活性较假手术组显著升高P0.01；但脑益康中、高剂量组大鼠脑组织AhE活性较模型组显著降低P0.01，提示中、高剂量脑益康具有较好的AhE抑制作用。脑益康通过抑制AhE，减少Ah的分解，从而改善AD大鼠的学习、记忆障碍。在中枢神经系统内，BuhE主要表达于胶质细胞，局部表达于内皮细胞和神经元，BuhE可能协同AhE调节中枢Ah程度。组织化学研究说明，某些胆碱能神经元含有BuhE而非AhE6。尽管AD患者脑组织中的AhE含量远高于BuhE，但是研究显示，在承受胆碱能神经纤维支配的皮层及海马，均有活化的BuhE7，在记忆、

16、认知和行为等方面发挥作用。随着AD的病情开展，BuhE活性进展性增加8。因此，抑制BuhE也可能有利于改善AD患者病症。临床随访说明，与多奈哌齐加兰他敏相比，AhE-BuhE的双重抑制剂如利凡斯的明能更好地改善AD患者认知才能9。本实验检测脑内BuhE活性显示，模型组大鼠脑组织BuhE活性显著升高P0.01，而脑益康中剂量组大鼠BuhE活性较模型组明显降低P0.05。提示脑益康对胆碱能系统损伤的AD大鼠脑组织中BuhE活性有影响。结果提示，脑益康通过抑制脑组织AhE和BuhE的活性，使脑内Ah含量增加，从而改善AD大鼠的学习、记忆才能。在轴突末稍的轴浆内，hAT催化乙酰辅酶A的乙酰基与胆碱结合

17、生成Ah。乙酰辅酶A来源于糖酵解，它必须从胆碱能神经元的线粒体转运出来。胆碱能神经元表达一种Na+-依赖性、密胆碱-3heihliniu-3,H-3敏感性的胆碱能转运体，负责将胆碱摄取到神经元10。当突触前神经元兴奋传到其轴突末稍时，突触前膜对a2+通透性增加，a2+的内流使突触囊泡向突触前膜挪动并与之交融，以胞吐方式释放Ah。胆碱能神经元受损引起的脑组织Ah含量减少，是学习、记忆才能下降的重要病理学基矗虽然Ah是最早被确定的一种神经递质，但是，因为Ah很不稳定，故本实验采用免疫组织化学染色方法观察AD大鼠脑组织hAT的表达。关于AD，最早并已经屡次被证实1113：随着患者病程的进展，大脑皮层

18、和海马的hAT表达程度及活性明显下降，降低程度与痴呆的严重度呈正相关。在AD患者中枢神经系统，出现严重的胆碱能系统功能退变，hAT异常表达导致Ah合成障碍，使神经传导缺乏必要的胆碱能递质，从而影响学习和记忆。本实验发现模型组大鼠基底前脑hAT表达程度明显下降，胆碱能神经元受损，主要表现为神经元着色变浅、阳性细胞数目减少P0.01、胞体缩孝突触不完好甚至消失，进一步证实了IB损伤NB与hAT的关系。而脑益康使基底前脑的hAT阳性细胞增多、hAT表达程度增加；尤其是脑益康中、高剂量组的阳性细胞数目比模型组显著增加P0.01，突触完好性增加，hAT表达程度增加。说明脑益康可以通过保护胆碱能系统，增强

19、胆碱能神经元功能，使胆碱能神经元的hAT，Ah程度增加，拮抗胆碱能神经元的损伤，改善AD大鼠的学习、记忆才能。脑益康对AD复杂发病机制中的多个靶点和环节起到明显的干预作用，在AD胆碱能系统损伤动物模型上表现出神经保护作用，通过抑制脑组织AhE和BuhE的活性，抑制突触处Ah降解；上调基底前脑和额叶皮层的hAT表达，使胆碱能神经元Ah合成增加，改善受损后功能下降的胆碱能神经元。【参考文献】1HuY,XiaZ,SunQ,etal.Aneapprahtthepharalgialregulatinfery:Sarsasapgeniniprveserybyelevatingthelusariniaety

20、lhlinereeptrdensityinbrainsfery-defiitratdelsJ.BrainRes,2022,1060(12):26.2PaxinsG,atsn.Theratbraininsteretaxirdinates.5thed.USA:ElsevierAadeiPress,2022:36.3PyhJ,hangQ,ln-Rivera,etal.AetylhlinereleaseinthehippapusandstriatuduringplaeandrespnsetrainingJ.Learne,2022,12(6):564.4ufsnEJ,GinsbergSD,IknviD,

21、etal.Huanhlinergibasalfrebrain:heanatyandneurlgidysfuntinJ.JheNeuranat,2022,26(4):233.5BartzkisG.AetylhlinesteraseinhibitrsayiprveyelinintegrityJ.BilPsyhiatry,2022,62(4):294.6GraybielA,Ragsdale.PseudhlinesterasestaininginthepriaryvisualpathayftheaaquenkeyJ.Nature,1982,299:439.7esula,GuillzetA,ShaP,etal.idelyspreadbutyrylhlinesteraseanhydrlyzeaetylhlineinthenralandAlzhEierbrainJ.NeurbilDis,2002,9(1):88.8LaneR,P