细菌内毒素检查2.凝胶法检查技术

1、凝胶法检查技术湛江安度斯生物有限公司2017年5月1凝胶法BET定义2凝胶法BET试验程序3试验器具4鲎试剂灵敏度复核试验5干扰试验6检查法凝胶法检查技术2（一）凝胶法BET定义定义：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。实验方法： 30.1ml鲎试剂溶液0.1ml供试品溶液371 602min阳性（+）阴性（-）+（一）凝胶法BET定义 结果判断阳性：凝胶不变形、不从管壁滑脱者阴性：未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者4（）（+）（二）凝胶法BET的试验程序试验准备确定样品内毒素限值选择试剂计算MVD鲎试剂灵敏度复核试验供试品干扰初筛试验干扰试

2、验日常检查结果判断5（三）试验材料和器具1.设备恒温仪器： 如干式恒温仪、恒温水浴箱旋涡混合器-混匀细菌内毒素温度计冰箱计时器或时钟微量移液器6需要定期校准！1.设备恒温干燥箱 -具有250以上恒温的功能 -验证：细菌内毒素灭活验证试验 最差装载运行3次（新）； -验证周期：每年一次； -检测（建议）：用具细菌内毒素含量和干扰情况； 7TAL-40型试管恒温仪的特点温控精确：370.2发热均匀：0.1可定时及提示：099分钟任意设定时，到时蜂鸣提示试管免封口，无水蒸气或水滴影响体积小巧，使用方便8内毒素标准品（RSE或CSE）细菌内毒素检查用水凝胶法鲎试剂其他辅剂（抗增液、稀释剂、稀释剂和分散

3、剂等）92.试剂用具分类试验用具名称反应试管无热原玻璃试管（外径10mm75mm）稀释容器稀释试管、无热原安瓿(2ml/支，5ml/支）移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头等其他试管架、安瓿架、70%异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记笔等3.试验用具10凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。（四）鲎试剂灵敏度复核试验实验室的条件实验人员的操作技能实验所用试剂实验所用器具 11验证是否满足BET实验的要求实验目的（四）鲎试剂灵敏度复核试验试验步骤 12开启恒温仪预热溶液C的制备鲎试剂的制备加样恒温反应结果判断数据处理操作步骤示意图稀释为2、0.5、

4、0.25内毒素标准溶液(C溶液)混匀*BET水复溶内毒素标准品：RSE或CSE按说明书要求鲎试剂单次试验试剂：原安瓿大装量试剂：反应试管鲎试剂复溶液复溶混匀轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合至少30秒130.1ml鲎试剂0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1ml鲎试剂0.1mlBET水，平行2管混匀（水浴恒温需封口）371，孵育60min2min操作步骤示意图14 结果判断： 反应管缓缓倒转180 阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者 阴性（-）：未形成凝胶或凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者 实验有效： NC管全部阴性（） 2.0管全部阳性（） 0.25管全部阴性（）数据处理：

5、灵敏度测定值c =antilg（X/n）X：为反应终点浓度的对数值（lg）鲎试剂灵敏度标示值有效：2c0.5反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度灵敏度复核试验举例试剂信息试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂安度斯0.1ml/支(1.25ml/支)0.25EU/ml18支(2支)内毒素标准品(CSE) 安度斯10EU/支1BET水 (W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1151.试验前，将恒温仪预热至37 ；2.0ml30s2.0ml2.0ml单位(EU/mL)30s130s0.4ml3.6ml10CSEBET水1.0ml混合5分钟30s2.0ml2.0ml2.0

6、ml0.5(2 )0.25( )2.0ml30s2.0ml0.125(0.5)0.06(0.25 )2.标准内毒素溶液C的制备；163.鲎试剂的准备(单次试验试剂)取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列；用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解分别加入0.1mL BET水复溶173.鲎试剂的准备(大装量试剂)取1.25ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂2支，在安瓿颈部折断，用精确移液器准确吸取1.25mlBET水分别加入两支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解。取1

7、8支（1075）mm反应试管，按照阴性对照溶液D两管，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：把两支鲎试剂合并后，分别取0.1ml鲎试剂溶液分装到18支反应试管中。分别加入0.1mL 复溶后的鲎试剂溶液184.加样用精确移液器分别吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的标准内毒素溶液C，加入复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿（或分装有0.1ml鲎试剂的反应试管）中，每浓度平行4管，吸取0.1mlBET水（溶液D）加入另外两管，作为阴性对照；0.06EU/ml分别加入CSE 0.1mLBET水0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU

8、/ml鲎试剂原安瓿反应试管加样顺序从低浓度到高浓度195.恒温反应将加样完的鲎试剂混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），垂直放入371的恒温器中孵育602分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）若恒温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染20结果判断：反应管缓缓倒转180 阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱 阳性阴性6.结果判断216.结果判断22试验符合要求的基本条件： NC管全部阴性 （）2管全部阳性 （） 0.25管全部阴性 （）当 c 在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试

9、剂的灵敏度。7.数据处理举例0.125平行管内毒素标准溶液浓度(EU/ml)NC反应终点浓度X（lg反应终点浓度）0.50.250.0610.1250.90320.250. 60230. 60240.250. 6020.2523c =antilg（X/n） =antilg(0.903)(0.602)(0.602)(0. 602)/4 = 0.210EU/ml 即本批号鲎试剂的复核灵敏度（ c ）为0.210EU/ml结论：本批鲎试剂的灵敏度标示值符合规定。7.数据处理举例24何时需做这个试验呢？1、使用新批号的鲎试剂2、试验条件有任何可能会影响检验结果的改变 25(五）干扰试验目的：确定供试品

10、在某种浓度下是否适合做细菌内毒素检查。原理：通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。至少对3批样品进行干扰试验26(五）干扰试验-反应项目设置27编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液12421440.5480.254C2/检查用水检查用水12221240.5280.252D无/检查用水2(五）干扰试验-反应项目设置注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。供试品溶液要求：未检验出内毒素的溶液即不与所用鲎试剂产

11、生坚实凝胶；不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液。如有可能，请留一个安全系数。28(五）干扰试验结果判断： 当溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。 当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。 29 新品种建立方法-两个厂家鲎试剂 鲎试剂的来源改变 鲎试剂的配方、生产工艺改变 供试品的来源改变 供试品的配方、生产工艺改变 试验环境中发生了其它有可能影响试验结果的变化在何种情况下需做干扰试验？30试验步骤试验材料的准备供试品限值的确定鲎试剂的选择MVD的计算反应溶液的制备加样及反应结果判断3

12、1(五）干扰试验干扰试验通常分为两个阶段：干扰初筛试验初步筛选出供试品无干扰浓度范围和鲎试剂灵敏度范围；非药典要求！干扰试验32(五）干扰试验经常接到用户的咨询电话，样品日常检查需要选择什么灵敏度的鲎试剂来检测？例如：我们产品的细菌内毒素限值是0.06EU，需要订什么灵敏度的鲎试剂，0.03可以吗？A、细菌内毒素限值单位不明确，是EU/ml还是EU/mg还是？单位不同，选择鲎试剂灵敏度范围不同；B、0.03EU/ml的鲎试剂可不可以，要做干扰试验来确定；C、通常可先做干扰初筛试验，初步筛选出鲎试剂灵敏度和无干扰浓度范围，再做干扰试验确认。331.干扰初筛试验目的及原理本试验是药品与鲎试剂相容性

13、的筛选试验，通过对一系列含2内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出样品对鲎试验无干扰的浓度本试验不是药典规定的试验34试验步骤试验材料的准备供试品限值的确定从国家药品标准、企业标准中查出L按公式计算：L=K/M试剂的选择可使用任一灵敏度的鲎试剂；一般为了试验的方便，选择灵敏度低的鲎试剂；35试验步骤供试品最大有效稀释倍数的确定例：某样品的内毒素限值为0.5EU/ml，则可以稀释的倍数和浓度范围如下36灵敏度（EU/ml)0.50.250.1250.060.03MVD0.5MVD0.25MVD0.125MVD0.06MVD0.03稀释倍数124816试验步骤反应溶液的制备溶液A：将供试品

14、稀释至鲎试剂常规灵敏度下所对应的MVD溶液B：含2浓度标准内毒素的溶液A溶液C： 2浓度的标准内毒素溶液溶液D：BET水37试验步骤加样及反应0.1ml鲎试剂溶液+0.1ml各反应溶液，各平行2管；结果判断试验有效条件：溶液D：（- -）；溶液C：（+ +）；无抑制干扰： 溶液A：（- -）；溶液B：（+ +）38举例：苦参素原料药干扰初筛试验（1）供试品限值企业内控标准：0.2EU/mg39（2）试剂为了方便试验，干扰初筛试验中一般选择灵敏度较低的鲎试剂作试验。试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24内毒素标准品（CSE） 安度斯10EU/支1BET水（W

15、） 安度斯50ml/瓶0.003EU/ml140（3）最大有效稀释倍数的确定最小有效浓度计算：C=/L使用=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时， =因此可计算出使用不同时所对应的C：灵敏度（EU/ml）0.50.250.1250.060.03对应的浓度（mg/ml）2.51.250.6250.3130.1560.5EU/ml 0.20EU/mg=2.5mg/ml41C0.5（4）各反应溶液的制备注: S2.5表示供试品2.5mg/ml，下标表示供试品浓度; E0.5 表示内毒素的浓度为0.5EU/ml。溶液编号AD溶液内容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管溶

16、液编号BC溶液内容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管42溶液C的制备溶液A43备用液E100.5ml0.5ml WE0.5溶液C： E2溶液A的制备1.4mlW1.4mlS0.313S101.4ml1.4ml WS51.4ml1.4ml WS2.51.4ml1.4ml WS1.251.4ml1.4ml WS0.6250.4ml3.6ml WE1备用液53.5mg5.35mlW混合1.0ml1.0mlS0.1560.5mlS5+0.5mlE1 1.0mlS2.5E0.50.5mlS2.5+0.5mlE1 1.0m

17、lS1.25E0.50.5mlS1.25+0.5mlE1 1.0mlS0.625E0.50.5mlS0.625+0.5mlE1 1.0mlS0.313E0.50.5mlS0.313+0.5mlE1 1.0mlS0.156E0.5更简单的干扰初筛试验溶液B制备方法：0.01mlE20+0.1ml供试品溶液+0.1ml鲎试剂溶液44溶液B： SE2注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒。溶液B的制备（5）加样及反应开启24支鲎试剂，分别用移液器准确吸取0.1ml BET水将鲎试剂复溶取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管另外取0.1ml B

18、ET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管371反应602分钟45（6）结果判断 当溶液D为阴性；溶液C为阳性时，试验有效结果1：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列全部是阳性结果2：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列在某一浓度处才开始是阳性结果3：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阳性结果4：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阴性46（6）结果判断结果1：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列全部是阳性47溶液编号AD溶液内容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液编号BC溶液内容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5

19、 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+48（6）结果判断结果1解读：供试品无干扰或干扰很小，可使用上述任一浓度进行干扰试验。（6）结果判断结果2：溶液A系列反应的结果全是阴性，溶液B系列在某一浓度处才开始是阳性49溶液编号AD溶液内容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液编号BC溶液内容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+-+-+50（6）结果判断结果2解读：供试品在某浓度开始无干扰，可选择该浓度或梯度递减的更低浓度（不超过MVD）进行干扰试验。

20、通常建议选择梯度递减下一个浓度，以防干扰状况处于临界水平。对于本例子，建议选择S0.625。（6）结果判断结果3：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阳性51溶液编号AD溶液内容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液编号BC溶液内容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管+-+-+52（6）结果判断结果3解读：样品内毒素含量高或增强（假阳性）。对于前者，建议更换另一批供试品进行测试。对于后者，消除干扰后再进行测试（比如使用抗增液等消除增强干扰的手段）。用光度测定法检测分析确定是

21、内毒素含量还是增强作用。（6）结果判断结果4：溶液A系列与溶液B系列反应的结果全是阴性53溶液编号AD溶液内容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156W平行管 溶液编号BC溶液内容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+-+54（6）结果判断结果4解读：强抑制（假阴性） 。消除干扰后再进行测试。如无法消除干扰，该供试品可能不适合使用凝胶法进行检测。可选择其他方法，如显色基质法。（6）结果判断-本试验结果55溶液编号AD溶液内容 S2.5 S1.25 S0.625 S0.313 S0.156

22、W平行管 溶液编号BC溶液内容 S2.5E0.5 S1.25E0.5 S0.625E0.5 S0.313E0.5 S0.156E0.5E0.5平行管-+溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性，试验有效；溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为 S2.5 2.干扰试验举例：苦参素原料药干扰试验（1）供试品限值企业标准：细菌内毒素含量0.2EU/mg56（2）试剂的选择根据干扰初筛试验的结果，供试品在2.5mg/ml（对应鲎试剂灵敏度为0. 5EU/ml）时无干扰;这里我们选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂对2.5mg/ml供试品进行干扰

23、验证试验。 Why？57预留4倍安全系数（2）试剂的选择试剂名称厂家规格标示效价数量鲎试剂安度斯0.1ml/支0.125EU/ml28内毒素标准品（CSE） 安度斯10EU/支1BET水 （W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1（3）最小有效浓度的计算MVC=/L=0.625mg/ml58溶液编号BA溶液内容 S2.5E0.25 S2.5E0.125 S2.5E0.06 S2.5E0.03 S2.5平行管数（4）各反应溶液的制备溶液编号 CD溶液内容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管数59ChP（2010年）平行管数4ChP( 2015年)平行管数2溶液C的制备0

24、.4ml30s10CSEBET水1.0ml1.8ml1.03.6ml30s30s30s1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml30s1.8ml1.8ml(EU/ml)溶液C混合5分钟0.25(2 )0.125( )0.06(0.5)0.03(0.25 )0.5(4 )60溶液A的制备61溶液A：S2.5BET水苦参素原料药53.5mg5.35mlS102.0ml2.0 ml0.5ml0.5 mlS5混合溶液B的制备E0.5S50.5ml0.5mlS2.5E0.25E0.25S50.5ml0.5mlS2.5 E0.125E0.125S50.5ml0.5mlS2.5

25、E0.06E0.06S50.5ml0.5mlS2.5 E0.0362（5）加样及反应开启64支鲎试剂，先分别用0.1ml BET水复溶,再分别加相应的溶液0.1ml（A、B、C和D）37 1反应602分钟0.25EU/ml(2)0.125EU/ml()0.06EU/ml()0.03EU/ml()BET水S2.5 E0.25(SE2)S2.5 E0.125(SE)S2.5 E0.06(SE)S2.5 E0.03(SE)S2.563（6）结果判断批号1-试验结果溶液编号 CD溶液内容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管数溶液编号BA溶液内容 S2.5E0.25 S2.5E0.

26、125 S2.5E0.06 S2.5E0.03S2.5平行管数+64试验有效+（6）结果判断批号2-试验结果溶液编号 CD溶液内容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管数溶液编号BA溶液内容 S2.5E0.25 S2.5E0.125 S2.5E0.06 S2.5E0.03S2.5平行管数+65试验有效+（6）结果判断批号3-试验结果溶液编号 CD溶液内容 E0.25 E0.125 E0.06 E0.03W平行管数溶液编号BA溶液内容 S2.5E0.25 S2.5E0.125 S2.5E0.06 S2.5E0.03S2.5平行管数+66试验有效+结果计算及判断c =antil

27、g（2(lg0.125) 2）= 0.125 EU/ml67计算鲎试剂标示灵敏度的对照系列，c：计算干扰试验系列， B ：）= 0.086 EU/mlB2 =antilg（(lg0.06) 2 +(lg0.125) 24）= 0.125 EU/mlB3 =antilg（(lg0.125) 44）= 0.104 EU/mlB1 =antilg（(lg0.06) +(lg0.125) 34 本试验： 溶液D：（- -） ； 溶液A：（- -） ； 用水稀释内毒素系列： 2管：（+ +） ；0.25管：（- -） ； c=0.125，0.5 c 2，试验有效! 用供试品稀释内毒素系列：三批样品B：0

28、.104/0.086/0.125； 0.5 c 2 。结论：使用灵敏度=0.125EU/ml的鲎试剂对样品(S)的浓度为2.5mg/ml的稀释液(S2.5)作BET，无干扰。结果计算及判断682.干扰试验若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。69问题讨论-溶液B的制备A、等比稀释法：取等量的浓度为4的内毒素溶液和浓2倍的供试品溶液，混合；例如制备 S80E0.25，取等量的0.5EU/ml内毒素溶液和40倍供试品溶液混合B、用供试品代替水稀释内毒素：例如制备S80E0.25 ，先用BET水溶解内毒素标准品再用80倍的供试品

29、溶液稀释至需要的内毒素溶液； S80E0.25：80倍的供试品溶液含0.25EU/ml的内毒素溶液采用方法B制备，第一步要稀释10倍！70（六）检查法凝胶限度试验 反应项目设置编号内毒素浓度配制内毒素的溶液平行管数A无供试品溶液2B2供试品溶液2C2检查用水2D无检查用水271 注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照； C为阳性对照； D为阴性对照反应项目意义溶液D：阴性对照监控试验是否受到外源性内毒素的污染，包括水、鲎试剂、用具和试验操作；平行两管都应为阴性，其中有一管为阳性，试验无效；外源性内毒素的含量小于使用鲎试剂的灵敏度72反应项目意义溶液C：阳性对照监控鲎试剂的灵敏度、内毒素标准品的

30、效价和稀释是否准确、恒温设备、用具是否存在干扰、人员操作是否准确和试验环境是否合适；平行两管都应为阳性，否则试验无效；为什么加入2浓度的内毒素，加入不是更好吗？-标示值范围！73反应项目意义溶液B：供试品阳性对照监控供试品是否有抑制作用，防止由于供试品有抑制作用而放行不合格产品；平行两管必须都为阳性，否则试验无效。74反应项目意义溶液A：供试品溶液确定在检测灵敏度是否有内毒素出现；阳性：供试品内毒素含量灵敏度稀释倍数阴性：供试品内毒素含量灵敏度稀释倍数稀释倍数不超过MVD；75（六）检查法凝胶法限度试验结果判断 溶液A溶液D溶液C溶液B符合规定- - -+ + +不符合规定+ +- -+ +

31、+需复测+ - -+ + +复测符合规定- - - - -+ + +复测不符合规定+ - - - -+ + +76结果判断试验有效！若供试品的稀释倍数小于MVD，需将供试品稀释至MVD重新实验，再对结果进行判断。试验步骤试验材料的准备供试品限值的确定试剂的选择MVD的计算反应溶液的制备加样及反应结果判断77举例：苦参素原料药凝胶限度试验1.供试品限值企业内控标准：内毒素含量0.2EU/mg78根据干扰试验结果，供试品在2.5mg/ml，使用鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml条件下，对BET无干扰本试验选择鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml，供试品稀释至2.5mg/ml检测2.试剂试剂名称厂家规

32、格灵敏度或效价数量鲎试剂安度斯0.1ml/支0.125EU/ml8CSE安度斯10EU/支1BET水(W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml1苦参素原料药(S)793.各反应溶液制备E0.5S50.6ml0.6mlS2.5 E0.25805.35mlWS101.0ml1.0ml WS50.6ml0.6ml WS2.5E100.4ml3.6ml WE11.6ml1.6ml WE0.50.6ml0.6ml WE0.25溶液C溶液A溶液B53.5mg混合4.加样及反应开启8支鲎试剂，分别加0.1mlBET水复溶；再分别加入相应的溶液，每浓度平行2管37 1反应602分钟溶液D（W）溶液C（ E0

33、.25 ）溶液A（ S2.5 ）溶液B（ S2.5 E0.25 ）各0.1mL各0.1mL各0.1mL各0.1mL81当需要复检时，A溶液平行4管，若所有平行管均为阴性，则供试品合格；否则不合格。无法判断：稀释至0.625mg/ml重新试验，再判断。溶液编号ABCD溶液内容S2.5S2.5E0. 25E0. 25W试验有效合格无法判断需复检复检合格复检不合格+5.结果判断82溶液编号ABCD溶液内容S2.5S2.5E0. 25E0. 25W结果+5.结果判断83试验有效样品内毒素含量0.125EU/ml/2.5mg/ml =0.05EU/mg结论：样品的内毒素含量小于0.05EU/mg，限值为

34、0.2EU/mg，符合规定。0.2/0.05=4,提供4倍安全系数5.结果判断84试验有效样品内毒素含量0.125EU/ml/2.5mg/ml =0.05EU/mg结论：样品的内毒素含量大于等于0.05EU/mg，限值为0.2EU/mg，无法判断。需将供试品稀释至0.625mg/ml重新试验再判断。溶液编号ABCD溶液内容S2.5S2.5E0. 25E0. 25W结果+（六）检查法-凝胶半定量试验凝胶半定量试验系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按下表制备溶液A、B、C、D。按照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 85（六）检查法-凝胶半定量试验编号内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释用

35、液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水12482222B2/供试品溶液122C2/检查用水检查用水1248210.50.252222D无/检查用水286注： A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液。从 通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD 。 B为含2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照） C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D为阴性对照（六）检查法-凝胶半定量试验87结果判断88试验有效条件 溶液D： 溶液B： 溶液C：0.5c 2 结果计算系列溶液A中每一系列的终点稀释倍数乘以 ，为每个系列的反应终点浓度（如

36、果检验的是经稀释的供试品，则将终点浓度乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。即得到每一系列内毒素浓度c。每一系列内毒素浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度CE=antilg（C/2）（六）检查法-凝胶半定量试验若每一系列内毒素浓度均小于规定的限值，判定供试品符合规定；若供试品溶液的所有平行管均为阴性，供试品溶液的内毒素浓度小于乘以初始稀释倍数；若任何系列内毒素浓度不小于规定的限值时，判定供试品不符合规定。当供试品溶液的所有平行管均为阳性时，供试品溶液内毒素浓度大于或等于乘以最大稀释倍数。（六）检查法-凝胶半定量试验89举例：氯化钠注射液凝胶半定量试验 1.内毒素限值氯化钠注射液(S),规格：250ml/2.25g;药典要求：氯化钠注射液的内毒素限值 L=0.50EU/ml 2. 试剂试剂名称厂家规格灵敏度或效价数量鲎试剂安度斯0.1ml/支0.06EU/ml20内毒素标准品（CSE）安度斯10EU/支1BET水(W)安度斯50ml/瓶0.003EU/ml190举例：氯化钠注射液凝胶半定量试验 3. MVD的计算 MVD=CL/ =1.0ml/ml0.50EU/ml/0.06EU/ml =8(倍）4.各反应溶液的制备溶液C的制备：将CSE稀释成E1.2