酶联免疫吸附试验全解

1、酶朕免疫及附试殓简介1971年，一住瑞典学者和一後椅鱼学者分别掖道将免疫技术发襄为检测体液中橄量畅质的阖相免疫测走方出，隸砾联免疫吸附试脸(ELISA)ELISAst是将抗虑和抗体的免疫反应和馨的催化反应相结合而建立的一种新找术。该技术应用非常广泛，几乎所有的可徐性抗原抗体糸统的可用以检测。ELISA出是免疫诊新中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生畅所引超的传染病.畫生玄病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗廉和小分子抗廉的走童测走，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敎、特异.简单.快速、稳定及易于偷动化操作等特氏。不倪适用子临床标本的检查，而且由子-天之内可以检查几

2、百芯至上千份标本,因此，也适合于血请流行病学调查。本法不仅可以用来测走抗体，而且也可用于测走体液中的循环抗凍，所以也是一种早期诊断的良好方宙。IfLJ汽本原理先将已知的抗体或抗点结合蛊禁种固相载体上,并镭持其免疫活性。测走对P将待检样本和酶标抗凍或抗体挨不同步骤与固相栽体表面吸附的抗体或抗凍发生反应。用洗涤的方肉洗去多余的分富抗虑抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底畅催化显色，进行定性或走量测走。反应模式酶联免疫及附试脸的主要技术类型有巩抗体夹心出、间接出、丸争出、捕获出、生杨素亲和素等。1,双抗体夹心法:此出帚用于检测执屢它是检测抗廉最常用的ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗虑决

3、定簇的多价抗廉，而不能用于小分子丰抗廉的检测。2，间接法测定抗体此肉帝用于测剣抗体将已知抗虑连接蛊固相载体上，待测抗体与抗廉结合后再与酶标二抗结合，形成抗斥待测抗体酶标二抗的复合畅,复合杨的形成童与待测抗体量成正比属非丸争性反应类型。3，竞争法此肉既可用于检测抗虑和半抗原的定量测走，也可用于测走抗体用酶标抗虑（抗体丿与待测的非标记抗廉（抗体丿丸争性的与固相载体上的限童抗体（抗凍丿结合，待测抗虑C抗体丿多，则形成非标记复合杨多，酶标抗虑与抗体结合就少，也就旻酶标记复合杨少，因此，显色程度与待测杨含童成反比。I如j列4,捕获法（反向间接法）主要用于测定血请中禁种抗体亚成分以目前最帯用的igM测定为

4、例，因血请中针对禁种抗廉的特异性IgM和IgG同对存症，而后者可干扰igM的测走。因此，先针对igM的第二抗体连接于固相栽体，用以“嫦获”样嬴中所有igM；洗涤除去igG等无关物质，然后加入特异性抗嫖与待测IgM结合；再次加入抗虑特异的砾标抗体;最后形成固相二抗-IgM-抗療酶标抗体复合肠，加酶底场显色后，即可对待IgM进行定性和定量测定。、込、*5,生物素-亲和素ABS为桌和素.生杨素糸统的略语。桌和素与生肠素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，桌和力大，两者一经结合就极为稳走。由于个索和素分子有4个生畅素分子的结合後置,可以连接更多的生畅素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把索和素和

5、生场素与EL1S偶朕起来，就可大提高EL1SA的牧感度。这种包被出不仅可增加及附的抗体或抗凍童,而且使其结合点充分暴彖。另外，农常规EL1SA中的酶标抗体也可用生杨素化的抗体椁代，然后连接桌和素-酶结合物f以放大反应信试剂组成：1包被板：包被有被检物质的抗原（抗体）2阴阳对照：主要为含被检物质的阴性阳性血清3酶标工作液：HRP（辣根过氧化物酶）4底物液A、B：TMB（四甲基联苯胺）5终止液：2MH2SO46浓缩洗涤液:PBS（磷酸盐缓冲液）仪器：3.PH0MO酶标仪1加样枪具体步骤1包被:将特异性抗体包被固相载体孵育一定时间，使形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质2加待检样本：孵育使标本中

6、的抗原与固相载体上的抗体充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3加入酶标抗体：孵育，使形成固相抗体待测抗原酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。4加入底物：显色固相上的酶催化底物产生有色产物通过比色，测标本中抗原的量。5加入终止：终止反应6结果判定：将酶标板放入酶标仪中，根据要求调整测量波长,在根据开单要求报定性定量值即可。1标本的影响嫁血，脂血标本请ELISA肉检测易卜生假阳性标本受细菌活染标本保存不自塑舞试管能吸附抗虑物质，样本久置蛊塑料管内会使样本内抗原含童下阵莲応假阴性JII-r山4代尸尸US/，*标本凝固不全2试剂影响ELISA检测狀利厂家较多；因选用国家就

7、准丈号，不同厂家出产的试制灵做度与特异性存磁一走的差别，使用质龙的试利必然导敷结果的假阳性或假阴性。试刘因姿昙榇管症4C冰箔内，使用裔要怨平衡童厦。不同馳号试利不能混用。因此，选择高质童的试利是保证结果准确的关钱O3操作技术的影响哌童的准确性狹量不准确，直接影响检测结果。因此加样春也要经常请洗P走期牧准厦浴影响抗原抗体结合及酶促反应对at度有严格要求。加择次序影响有对我们在加样过程中，带带会遇到个别标本未窝心等惜况，为了节细对间，往往这对我们会先加砾结合肠，然后等标本分富好后再加标本，这样帝帝会凌成假阴性。洗涤方肉对结果的彩响冼涤旻ELISA操作的重要环节手洗条件一政性较差，4干扰物质的影响大约40%的人血请标本中含有非特异性干扰賜质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰畅质有：类庵湿因子、补体、交叉反应杨质和其他畅质等药物的影响：如有些富败价的免疫球姜等应用ELISAS由于测定灵敘.特异.操作简便.酶标记试利比较稳走.易于令动化.无反射性汚染，且易与其他相关技术偶朕，使