分子生物学检验：E-coli JM109感受态细胞的制备与转化

1、E.coli JM109感受态细胞的制备与转化1.目的（1）掌握大肠杆菌感受态细胞的原理和方法 （2）掌握制备大肠杆菌感受态细胞的操作方法实验原理:感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 法，简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。CaCl2法制备感受态细胞的原理是：细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使位于外膜和内膜间隙中的部

2、分核酸酶解离，诱导形成感受态细胞。待转化DNA和Ca2+形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐复合物粘附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经42短时间热激处理，细菌细胞膜的液晶结构发生改变，出现许多间隙，通透性增加，促进细胞吸收DNA复合物。在营养丰富的培养基上生长数小时后，受体细菌分裂增殖，被转化到细菌细胞中的重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上，可筛选出所需的阳性转化子。【材料 】 E.coli JM109大肠杆菌，100ml三角瓶，1.5ml 离心管(又称eppendorf管), 离心管架，1000 ul 、200ul，10 ul枪头，大量碎冰。【设备 】微量移液器(2

3、00l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，恒温摇床、高速冷冻离心机, 超净工作台，双蒸水器，冰箱等。【试剂准备】1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3 0.1mo1L CaCl2 母液1M CaCl2 147 g CaCl2 2H2O，加水到1L【操作步骤 】大肠杆菌感受态细胞的制备方法1 CaCl2法（已预先准备好）从新活化的E.c

4、oli JM109菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种5ml 不含氨苄青霉素的LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。取该菌悬液以100l转接于5ml LB液体培养基中，37剧烈振荡约2小时，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.3-0.4时停止培养；取培养液1.5ml转入微量离心管中，在冰上冷却10min，于4，5000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，04，5000rmin离心10min；弃去上清液

5、，加入1ml 冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，12000rmin离心2min；弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后在超净工作台分装到Eppendorf微量离心管中，液氮速冻后，置于-70条件下，可保存半年至一年。方法2 PEG介导的感受态细胞制备【材料 】 重组质粒PUC-U6及空载体质粒PUC119，JM109大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，1-10 ul、1000 ul、200ul枪头，

6、9cm培养皿，一次性滤器（0.22um），大量碎冰【设备 】 微量移液器(2l,200l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇床，离心机， 超净工作台，双蒸水器，冰箱，制冰机等。【试剂准备】 LB固体培养基 LB液体培养基氨苄青霉素（AMP）：无菌水配置成100mg/ml溶液，用滤膜抽滤，-20保存灭菌双蒸水ddH2O DMSO MgCl2， MgCl2 PEG6000【实验操作】（1）配制TSS转化液TSS:7.0ml pH6.1 LB液体培养基2.0ml 50% PEG60000.5ML DMSO0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 a

7、nd 0.1ml 1mol/l MgSO4)0.3ml ddH2O用0.22um滤器抽滤除菌后放置于28待用。 （2）单菌落平板至5ml LB, 37 250 rpm过夜培养, 100l 转至5 ml LB, 37 280 rpm至 A600=0.2-0.4，取0.5 ml呈对数期生长的菌液5000rpm离心10分钟后用100lTSS重悬后即成感受态细胞，将盛有感受态度细胞的EP管插到冰盒中放置30分钟以上.（3）转化: 加质粒(5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42 90秒，冰上2分钟，加LB至0.5ml, 37 1小时后铺抗生素平板。（4）在菌液完全被培养基吸收后，培养皿倒

8、置于37培养箱中过夜(1216小时)，观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。第2步 重组DNA质粒的转化受体细胞经过一些特殊方法等化学试剂法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗

9、传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 【材料 】 重组质粒及空载体质粒，JM109大肠杆菌感受态细胞 ，1.5ml塑料离心管，离心管架，1-10 ul、1000 ul、200ul枪头，9cm培养皿，一次性滤膜（0.22um），大量碎冰【设备 】 微量移液器(2l,200l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇床，离心机， 超净工作台，双蒸水器，冰箱，制冰机等。【试剂准备】 LB固体培养基 LB液体培养基氨苄青霉素（amp）：无菌水配置成100mg/ml溶液，用滤膜抽滤，-20保存灭菌双蒸水ddH2O【实验操作】 （1）准备工作：开水浴，调至42。平板的

10、制备：LB固体培养基中加入苄星青霉素(200 mg/ml)，转化反应前一天，倒置平板，保存。（2）PUC119-U6转化组：2l pUC119质粒DNA+ pUC119-U6 50l感受态细胞悬液(3) 从-80冰箱中取出JM109大肠杆菌感受态细胞，握在手中，使其解冻，轻轻flick（刮弹），勿振荡勿上下颠倒，加50l至每个EP管中，flick，放至冰盒中30min。（4）热休克：将离心管置于42水浴中保持90s，然后迅速冰上冷却2min。（5）立即向上述管中分别加入800l LB液体培养基（42预热）（在超净工作台操作，不需要在冰上），摇匀后于置于37摇床振荡培养约1-1.5h，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素抗性标记基因。（6）每个LB平板加100l IPTG, 然后取20l X-gal加到IPTG上（X-gal加到IPTG圆心中）,然后烧涂棒，冷却后可先放在边缘，再开始涂匀（动作迅速，因混合物干得快）。涂完后将LB平板放置37摇床，30min后取出置超净台上。（7）1.5 h后取出EP管，3000rpm ,3min。离心后细菌沉淀在底部，枪