乳与乳制品病原微生物检验方法沙门氏菌的检验

1、乳与乳制品病原微生物检验方法沙门氏菌的检验 YLNB 4.3方法一：国标法1. 仪器及器材1.1 冰箱：0-41.2 恒温培养箱：3611.3 显微镜：10100均质器或灭菌乳钵天平：0-500g，精度0.5g灭菌试管：10mm100mm、16mm160mm灭菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）灭菌锥形瓶：500ml、100ml灭菌培养皿：直径90cm灭菌小试管：3mm50mm灭菌毛细管。2. 培养基和试剂2.1缓冲蛋白胨水(BP)：按GB 4789.28中4.12规定。2.2 氯化镁孔雀绿(MM)增菌液：按GB 4789.28中4.13规定。2.3 四硫酸钠煌绿

2、(TTB)增菌液：按GB 4789.28中4.14、4.15规定。2.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：按GB 4789.28中4.16规定。2.5 亚硫酸铋琼脂(BS)：按GB 4789.28中4.19规定。2.6 DHL琼脂：按GB 4789.28中4.20规定。2.7 HE琼脂：按GB 4789.28中4.21规定。2.8 WS琼脂：按GB 4789.28中4.23规定。2.9 SS琼脂：按GB 4789.28中4.22规定。2.10 三糖铁琼脂：按GB 4789.28中4.26，4.27规定。2.11 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28中3.13规定。2.12 尿素琼脂(pH

3、7.2)：按GB 4789.28中3.15规定。2.13 氰化钾(KCN)培养基：按GB 4789.28中3.16规定。2.14 氨基酸脱羧酶试验培养基：按GB 4789.28中3.12规定。2.15 糖发酵管：按GB 4789.28中3.2规定。2.16 ONPG培养基：按GB 4789.28中3.3规定。2.17 半固体琼脂：按GB 4789.28中4.30规定。2.18 丙二酸钠培养基：按GB 4789.28中3.7规定。2.19 沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型；57种用于进一步分型；163种用。3. 检验程序 直接增菌法鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品 25g+灭菌生理盐水

4、25ml,做成检样匀液前增菌法冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品 25g+BP 225ml361 一般4h 干蛋品18 h24h 检样匀液25ml+SC 100ml检样匀液25ml+MM（或TTB)100ml10ml+SC100ml10ml+MMA(或TTB)100ml42 18 h24h 361 18 h24h 42 18 h24h 361 1824hBSDHL(或HE、WS、SS)361 40h48h 36140h-48h挑取可疑菌落TSI(斜面、底层、产气、H2S),蛋白胨水（靛基质），尿素（PH7.2），KCN，赖氨酸非如左述的各种反应结果H2S 靛基质尿素KCN赖氨酸+/-H2S+ 靛基

5、质+尿素KCN赖氨酸+H2S+ 靛基质尿素KCN赖氨酸+ ONPG甘露醇沙门氏菌血清学实验非沙门氏菌非沙门氏菌沙门氏菌血清学实验报 告4. 方法4.1 前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。各称取检样25g，加在装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以800010000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于361培养4h(干蛋品培养1824h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42培养1824h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸增菌液内，于

6、361培养1824h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于361培养1824h。4.2 分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于361分别培养1824h(DHL、HE、WS、SS)或4048h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌、和沙门氏菌在各个平板上的

7、菌落特征见表1。表1沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征于详细分型。选择性琼脂平板沙门氏菌、沙门氏菌（即亚利桑那菌）亚硫酸铋琼脂产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色有金属光泽DHL琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与沙门氏菌、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，带中心带黑色HE、WS琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色SS琼脂无色半

8、透明，产硫化氢菌株有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与沙门氏菌、相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，带中心带黑色，但中心无黑色形成时与大肠艾希氏菌不能区别对可疑的菌落可挑取单菌落做沙门氏菌全套生化试验和血清学试验。4.3 生化试验和血清学试验按照GB/T4789.4-2003进行。5. 结果报告如果在各种选择性培养基上无菌落生长，则报告“阴性”或“未检出”；如果有可疑菌落出现，可报告“有可疑菌落”或进一步做生化试验及血清学试验鉴定后报告“阴性”或“阳性”。方法二：显色培养基法1. 仪器及器材 恒温培养箱：361 水浴锅：420.2 灭菌锥形瓶：300ml、500ml

9、灭菌吸管：1ml、10ml 灭菌培养皿：90mm2. 培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（BP）：蛋白胨 10g氯化钠 5g磷酸氢二钠（NaHPO4.12H2O） 9g磷酸二氢钠 1.5g蒸馏水 1000mlPH7.2以每瓶225ml分装于300ml锥形瓶中，121高压灭菌15min备用。 RVS增菌肉汤： 沙门氏显色培养基： 营养琼脂： 全套生化试验和血清学试验试剂：见GB/T4789.4-20033. 方法 以无菌操作取25g（ml），加在装有225ml缓冲蛋白胨水的300ml锥形瓶中（有玻璃珠数粒），摇动数分钟，使样品完全溶解。 吸取1ml样品液加入9mlRVS肉汤中，在420.2的水浴锅或培养箱内，增菌培养242小时。 用3mm接种环取1环增菌液，划线接种到沙门氏显色培养基上，做2个重复。 361培养24-28小时，观察菌落形态。 沙门氏菌（伤寒沙门氏菌除外）显亮红色，大肠杆菌和大肠菌群显蓝色，枸橼酸杆菌显紫色，其它细菌显黄色或无色。 对可疑的菌落可划线到营养琼脂平板上，361培养1