乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验

1、乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验 YLNB 4.61. 仪器及器材1.1 恒温培养箱：301、2411.2 恒温水浴锅：461。1.3 显微镜：101001.4 离心机：4000 r/min1.5 均质器或灭菌乳钵。1.6 灭菌平皿：直径90mm。1.7 灭菌试管： 16mm160mm1.8 灭菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL刻度）。1.9 冰箱：041.10 锥形瓶：100mL、500mL。1.11 架盘药物天平：0g500g,精确至0.5g。1.12 离心管：30mm300mm。1.13 灭菌注射器：11.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。1

2、.15 马红球菌。1.16 小白鼠：16g18g。2. 培养基和试剂 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSBYE)：见附录A1。 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSAYE)：见附录A2。 EB增菌液：见附录A3。2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。2.5 三糖铁(TSI)琼脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。2.6 SIM动力培养基：见附录A5。2.7 血琼脂：GB/T4789.28中4.6。2.8 改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。2.9 硝酸盐培养基：GB/T 4789.28中3.17。2.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB/

3、T4789.28中3.4。2.11 糖发酵培养基：GB/T4789.28中3.2。2.12 过氧化氢酶试验：GB/T4789.28中4.38。2.13 盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。2.14 萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。3. 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：检样25g(ml)LB1增菌液225mlEB增菌液225ml30,48h 30,24hLB2增菌液225ml30,24h 选择性培养基(MMA)30,2448h TSI琼脂SIM动力培养基25 2d5d(伞状) 30,24hTSA-YE培养基30,24h 溶血实验MR-V

4、P实验小鼠致病力实验协同溶血实验革兰氏染色显微镜下观察运动硝酸盐还原实验过氧化氢酶实验甘露醇七叶苷鼠李糖木醇 4. 方法4.1 样品的收集及处理无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4冰箱。4.2 增菌培养EB增菌液放301培养48h，LB1增菌液225mL放301，培养24h，吸取0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。4.3 分离培养将EB增菌液和LB2二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养301 48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。4.4

5、选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和SIM动力培养基，培养于251，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察27d，阳性者可做下一步鉴定。4.5 纯培养将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSAYE)上，做纯培养供做以下鉴定。4.6 染色镜检将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.40.5m0.52.0m；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。4.7 生化特性将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主

6、要生化特性及有关菌的区别见表1。表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别菌种溶血反应 硝酸盐还原 尿素酶 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌+ - - +/+ - + - +绵羊李斯特氏菌+ - - +/+ - - - +英诺克李斯特氏菌 - - - +/+ - V - +威尔斯李斯特氏菌 - - - +/+ - V + +西尔李斯特氏菌 + - - +/+ - - + +格式李斯特氏菌 - - - +/+ + - - +默氏李斯特氏菌 - + - +/+ + V - +注：V反应不定；+阳性；-阴性。4.8 对小鼠的致病力试验将符合上述特性的纯培养物接种于

7、TSBYE中，在30培养24h，离心，浓缩，使浓缩液每毫升1010/mL个细菌，取0.5mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔，35只，观察小鼠死亡情况。致病株于25d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。4.9 协同溶血试验(cAMP)在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌(R.equi)，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们，在30培养2448h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。附录A 培养基(补

8、充件)A1含0.6%酵母漫膏的胰酪胨大豆肉汤(TSBYE)A1.1成分胰胨17g多价胨3g酵母膏6g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g 蒸馏水1000mLA1.2制法将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.27.4，分装，121灭菌15min，备用。A2含0.6%酵母膏胰酪胨大豆琼脂(TSAYE)A2.1成分胰胨17g多价胨3g酵母膏6g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g琼脂15g蒸馏水1000mLA2.2制法将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.27.4，分装，121高压灭菌,备用。A3EB增菌液A3.1成分胰胨17g多价胨3g酵母膏6g氯化钠5g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5

9、g蒸馏水1000mL盐酸吖啶黄15mg/L萘啶酮酸40mg/LA3.2制法除吖啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合调pH至7.27.4，12115min高压灭菌。使用前加吖啶黄溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。A4李氏增菌肉汤(LB1，LB2)A4.1 成分胰胨5g多价胨5g酵母膏5g氯化钠5g磷酸二氢钾1.35g磷酸氢二钠12g七叶苷1g蒸馏水1000mLA4.2制法将上述成分加热溶解，调pH至7.27.4，分装，12115min高压灭菌。A4.2.1李氏I液(LB1)225mL中加入：1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制) 0.45mL1%吖啶黄(用灭菌蒸馏水配制)0.27mLA4.2.2李氏液(LB2)200mL中加入：1%萘啶酮酸 0.40mL1%吖啶黄 0.50mL无菌分装于10mL大试管中。A5改良的Mc Bride琼脂(MMA)A5.1成分胰胨5g多价胨5g牛肉膏3g葡萄糖1g氯化钠5g磷酸氢二钠1g苯乙醇2.5mL无水甘氨酸10g氯化锂0.5g琼脂15g蒸馏水1000mL