免疫组化讲稿

1、关于免疫组化第一张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 一 免疫组织（细胞）化学的概念 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC） 又称免疫细胞化学（immunocytochemistry， ICC），组织化学的分支。 利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使连接在抗体/抗原上的标记物的显色来确定组织细胞内抗原/抗体，对其进行定位、定性及定量的研究技术。 第二张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均可用免疫组织化学方法显示而进行定性、定位分析或定量研究

2、，进而深入研究其功能。 解决三大问题： 有没有？ 在哪里？ 多与少？第三张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 特点 优点 特异性强，定位准； 结果直观； 形态学改变与功能和代谢相结合； 组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。 缺点 步骤多，影响实验成败的因素多； 以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量 分析尚需标准化。 第四张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 二 免疫组化技术的基本步骤1.制片 组织切片(石蜡切片、冰冻切片) 细胞爬片 组织印片 血液涂片2.抗原抗体反应标记物的显色（反应）3.指标检测分析 采集图像数据测量结果分析 第五张，PPT共二十九页，创作于2022年6月石蜡

3、切片细胞爬片第六张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 三 免疫组化的分类（1）根据标记物的性质 必要性：组织细胞内AgAb结合反 应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有颜色的标记物。第七张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 酶 原理：基于酶与底物发生反应并产生不溶性有色产物。 特点：不需要特殊的显微镜； 染色后的标本可长期保存； 可以进行复染，使形态更明确； 可根据酶和底物的不同而显示不同的颜 色，易进行双重或多重染色。 第八张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 常用酶辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP) 底物：DAB(四盐酸二氨基联苯

4、胺)，产物为棕褐色。碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP） 底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD） 底物：葡萄糖，产物为蓝色。注意：DAB有潜在的致突变作用第九张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 荧光素 原理：吸收特定范围波长的光而激发其自身发出另一范围波长（颜色）的光。 特点：需要荧光显微镜观察结果； 标本不能长期保存； 敏感性高，背景低； 标本可以用多种荧光素标记。 第十张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 常用荧光素异硫氰酸荧光素 (fluoresceinisothiocyanate, FITC)，

5、最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为520530nm，呈明亮的黄绿色。四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200），最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色。藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE），最大吸收波长约490nm，最大发射约为677nm，呈红色。第十一张，PPT共二十九页，创作于2022年6月(2) 按抗体、抗原与标记物的作用方式 直接法： 特异性抗体（一抗）与抗原结合； 标记物直接连接在一抗上。组织抗原第一抗体标记物第十二张，PPT共二十九页，创作于2022年6月特点： 方法简单、省时，专一性强； 非特异染色轻； 敏感性

6、差； 一种标记抗体只能检测一种抗 原。第十三张，PPT共二十九页，创作于2022年6月间接法 一抗与待检测的抗原结合； 二抗与一抗结合（一抗作为二抗的抗原）； 标记物连接在二抗上。组织抗原第一抗体第二抗体标记物第十四张，PPT共二十九页，创作于2022年6月特点： 敏感性高； 一种标记抗体（二抗）能用于同一中物种中多种抗原的检测； 样本1：兔（VEGF） 样本2：人（P53） 一抗：小鼠抗兔（IgG） 一抗：小鼠抗人（IgG) 二抗：HRP标记山羊*抗*小鼠IgG 费时，非特异染色稍重。 第十五张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 四 抗体的选择及保存和反应条件（1）抗体的种属来源（宿主

7、） 样本，一抗，二抗来自于不同种属 样本：大鼠 样本：人 一抗：兔 一抗：小鼠 二抗：山羊 二抗：兔（2）反应特异性 该抗体适合检测哪些种属动物体内的抗 原，不同种属间可能存在反应差异。第十六张，PPT共二十九页，创作于2022年6月（3）类型 单克隆抗体(小鼠来源),多克隆抗体。 （4）应用范围 IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHCP),冰冻切片(IHCFr), 甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位 亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。第十七张，PPT共二十九页，创作于2022年6月国外主要抗体试剂公司 第十八张，PPT共

8、二十九页，创作于2022年6月（7）抗体的保存与孵育条件 保存的条件 一抗：用前分装，20； 使用后，4 。 标记二抗: 用前放于4 ； 长期不用，20； 解冻后，4 。 避免反复冻融。第十九张，PPT共二十九页，创作于2022年6月孵育的温度与时间 一抗：4过夜（ 室温 30min1h） 37 ， 1-2h。 二抗:室温或37， 30min1h 。 浓度 每次使用新抗体前应当对其工作浓度 进行稀释测试，使阳性染色强而无背 景染色。第二十张，PPT共二十九页，创作于2022年6月抗体稀释度的棋盘稀释测定法注：括号内为背景染色第二十一张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 五 封闭血清的选择

9、（1）原因：样本里高电荷成分非特异性吸收抗 体；样本里可能含Fc受体而与抗体恒定区 结合。（2）来源： 与二抗同一来源的正常动物血清, 非一抗来源的动物(牛，马)的血清, 2%牛血清白蛋白（BSA）。 加一抗前，室温或37，10-30min。 处理完后直接加一抗，不洗涤。 第二十二张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 六 内源性酶灭活的问题（1）原因： 在以酶做标记物时，内源性酶和生物素易与底物竞争结合而引起非特异性染色。（2）方法： a:去除一般性酶 3%H2O2 ,10min； 0.3%H2O2-甲醇 ，1030min。 现用现配，避光,干燥处保存。 第二十三张，PPT共二十九页，创

10、作于2022年6月 b:去除内源性生物素 0.01卵白素，20min。 c:去除碱性磷酸酶 加入24mg/mL的左旋咪唑于底物液中， pH维持在7.6-8.2。 d:去除酸性磷酸酶 加入50mmol/L的酒石酸于底物液中。第二十四张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 七 对照染色设计(1)阳性对照:用已证实含靶抗原的标本与待 检标本同时做同样染色处理。 (2)阴性对照：用证实不含靶抗原或缺少免 疫试剂的同步处理和标记染色的对照。 a.阴性组织对照 以确知不含靶抗原的组织（细胞）标 本片与待检标本片同时染色。第二十五张，PPT共二十九页，创作于2022年6月b.阴性试剂对照 空白对照：用不加一抗的缓冲液（如 PBS）替代一抗。 替代对照：以第一抗体同源动物未免疫的正常血清或与本实验无关的抗体代替一抗。 吸收试验：第一抗体被过量的经纯化的抗原中和吸收，使其结合点全部被外源性抗原封闭。 抑制试验：待检标本先与未标记的特异性抗体反应，再与标记的特异性抗体结合，使染色结果明显减弱或转阴。 第二十六张，PPT共二十九页，创作于2022年6月 （3）自身对照