分子荧光分析法

1、分子荧光分析法第1页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一1575：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象1852：Stokes 研究荧光，提出作为一种分析手段1867：Goppelsroder首次应用方法1880：提出荧与化学结构关系的经验法则1928：Jette和West 第一台光电荧光计1952：第一台商品化的荧光分光光度计特点：1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb；2)选择性强；3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。3.1 荧光分析的基本原理第2页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.1 荧光分析的基

2、本原理分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。荧光和磷光: 当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光，当紫外光照射停止时, 随之消失的光叫做荧光，不立即消失的光叫磷光。第3页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.1 荧光分析的基本原理分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)。电子激发的多重度：M=2s+1Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。单重态: 如果分子中

3、全部轨道里的电子都是自旋配对的, s=0, M=1三重态：电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，s=1,M=3S0S1S2T1T2分子发光的产生 第4页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一去活化发射光子非辐射跃迁化学反应荧光磷光振动驰豫系间跨越内转换外转换激发光去除后，荧光立即消失激发光去除后，磷光不会立即消失熄灭或猝灭3.1 荧光分析的基本原理分子发光的产生第5页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.1.2 激发光谱和发射光谱 激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 激发光谱形状与

4、吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！ 发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？吸收池光源检测器单色器信号显示系统单色器第6页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一荧光激发光谱与发射光谱的特征a.Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。b.发射光谱的形状与激发波长

5、无关 分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振动能级 尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。无论激发波长是1还是2，荧光的波长都是23.1.2 激发光谱和发射光谱 激发光谱的形状与发射波长也无关第7页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一ex =290nm (MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm (MAX)em= 620nm(MAX)S04321S143211

6、41 31 2111 41 41 21 1c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等第8页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱第9页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.1.3 荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率影响因素：荧光产生过程中，

7、辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关； kf 分子结构决定（内因）； 主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。第10页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一n振动弛豫激发 n荧光（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命10-710-9s串越至三重态几率小第11页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一（2）具有大的共轭键结构共轭度越大，荧光越强。原因 ：共轭体系越大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽丁 省戊 省exmax(nm)205286365390580emm

8、ax (nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52第12页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一（3）具在刚性平面结构 0.9210.18第13页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一1）给电子取代剂加强荧光（4）取代基效应HN2， NHR ， NR2， OH， OR ， CN产生 p 共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1 T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚 emmax (nm)278310285365310405280390285345相对荧光强度10182020202）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光C=0，

9、COOH ， NO2不产生 p 共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光第14页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质F=0.75F=0.03立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质第15页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。（5）重原子取代基效应Cl， Br ， IS1 T1的系间窜跃由于重原子的存在增强第16页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一第17页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.1.4 溶液的荧光

10、强度1 荧光强度与溶液浓度的关系当lc0.05第18页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2 影响荧光强度的环境因素1）溶剂对荧光强度的影响一般溶剂效应介电常数、折射率特殊溶剂效应溶剂与荧光物质间的特殊作用溶剂相对介电常数荧光峰/nm荧光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率极性增加，荧光效率增加；粘度增加，荧光效率增加第19页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一2 影响荧光强度的因素2）温度对荧光强度的影响随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光

11、量子产率及荧光强度将降低 不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱（在邻二苯中） 碰撞几率增大粘度降低第20页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3）介质酸度的影响 2 影响荧光强度的因素具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，荧光体的存在型体不同，不同的型体(分子与其离子)在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别 苯胺：弱的有机碱 在碱性溶液pH712中以分子形式存在，蓝色强荧光在酸性pH13以离子形式存在，荧光弱。第21页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3 溶液荧光的猝灭荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的现象1） 碰

12、撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞2）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧 光配合物3） 转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧4） 发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与Fe2+5）荧光物质自猝灭第22页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.2 荧光光谱仪吸收池光源检测器单色器信号显示系统3.2.1 荧光光谱仪基本结构单色器与紫外-可见光谱仪的不同第23页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一光源1. 光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.氙灯光源常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源波长范围：2001000nm工

13、作压力：520 atm启动电压：2040KV使用寿命：10002000h最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽 发射光强度大第24页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一单色器第一单色器：在光源与样品池之间，滤去不需要的光，得到所需要的激发光。第二单色器：在样品池与检测器之间，滤去溶剂、容器表面散射光，瑞利和拉曼光以及杂质发出的散射光等，获得待测物质发射的荧光。 光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？第25页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一检测器光电倍增管 放大倍数：2n5n;n=10,1

14、03107， 最大108109样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围3. 使用注意事项容易破碎问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？沾污问题第26页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.3 分子荧光分析法的应用3.3.1 荧光分析法分类一、直接荧光法问题：基体干扰较为严重芳香族有机化合物分析二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）衍生化法或荧光探针法待测物与衍生化试剂发生化学反应3.3.2 荧光定性分析与标准品的激发

15、和发射光谱谱图进行对照三、荧光分析法特点1)灵敏度高（1-100 ppb)：有的可达0.01ppb；2)选择性强；3)方法简单快速，用样量少; 4)提供比较多的物理参数。 第27页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.3.3 荧光定量分析定量依据1. 标准曲线法（校准曲线法）2. 单点校正法（标准对比法）c1c2c3c4c5cxcscxA sA xcs和cx应很接近第28页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3.3.4 荧光分析法的应用1 无机化合物的荧光分析衍生化法：与荧光试剂形成荧光配合物第29页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一3

16、.3.4 荧光分析法的应用2 有机化合物的荧光分析3 生物大分子的荧光分析直接法：可测定的化合物很少衍生化法：与荧光试剂形成共价化合物待测物试剂 exmaxemmax测定范围 ppm丙三醇苯胺紫外蓝色0.12糠醛蒽酮4655051.515氨基酸氧化酶3154250.0150维生素A无水乙醇345490020蛋白质曙红丫紫外5400.066肾上腺素乙二胺4205250.0010.02 青霉素-甲氧基-氯-(-氨乙基)-氨基氮杂蒽4205000.06250.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.0010.033胍基丁胺邻苯二醛3654700.055四氧嘧啶苯二胺36548510-4第30页，共31页，2022年，5月20日，10点6分，星期一一、什么是分子发光？分子发光有哪几类？二、分子荧光或磷光是如何产生的？三、什么是荧光激发光谱？什么是荧光发射光谱？各有何特点和作用？四、为什么荧光发射光谱与激发光波长无关？五、何谓Stokes位移？Stokes位移是如何产生的？六、分子产生荧光的必备条件是什么？七、什么是应光量子产率？什么样结构的化合物分