生化分析仪常用分析方法共有三大类分别为终点法、固定时间法和动力学法

1、生化分析仪常用分析方法共有三大类，分别为终点法、固定时间法和动力学法。 终点法：指经过过一段时时间的反反应，反反应达到到平衡，由于反反应的平平衡常数数很大，可认为为全部底底物(被测物物)转变成成产物，反应液液的吸光光度不再再变化，只与被被测物的的浓度有有关。这这类方法法通常称称为“终点”法，更更确切地地说应称称“平衡”法。单试剂单单波长终终点法：t1时刻刻加入试试剂（体体积为VV），t22刻加入入样本（体积为为S），然然后搅拌拌并反应应，之后后开始测测量反应应液的吸吸光度，在t3时时刻反应应达到终终点，tt3t2为测测定时间间。反应度度RAt33At22-1V/(VS)，或或RAt33ARBB

2、LK。其中：Atii为i时刻的的吸光度度，ARRBLKK为试剂剂空白吸吸光度。单试剂双双波长终终点法：基本上上同“单试剂剂单波长长终点法法”，只是是对于每每一个测测定周期期，其实实际吸光光度等于于A1A2。双试剂单单波长终终点法：t1时刻刻加入第第一试剂剂(体积为为V1)，t2时刻刻加入样本本(体积为为S)之后后立即搅搅拌，tt3时刻刻加入第第二试剂剂(体积为为V2)并立立即搅拌拌，t44时刻反反应达到到终点。t3-t2为为孵育时时间,tt4-tt3为测测定时间间。在项目参参数中，如果反反应起始始时间设设为0，则反反应度RR=A时时刻吸光光度-双试剂剂空白吸吸光度。如果果反应起起始时间间小于0

3、0，则反反应度RR=Att4 -双试剂剂空白吸吸光度-t3到到t2间设设定点的的吸光度度（V1S）/(VV1SV2)。双试剂双双波长终终点法：基本上上同“双试剂剂单波长长终点法法”，只是是对于每每一个测测定周期期，其实实际吸光光度等于于A1A2。固定时间间法：又又称为一一级动力力学法、二点动动力学法法等，指指在一定定的反应应时间内内，反应应速度与与底物浓浓度的一一次方成成正比，即v=kSS。由由于底物物在不断断的消耗耗，因此此整个反反应速度度在不断断的减小小，表现现为吸光光度的变变化越来来越小。这类反反应达到到平衡的的时间很很长，理理论上可可以在任任意时间间段进行行监测，但由于于血清成成份复杂

4、杂，反应应刚启动动时反应应较复杂杂，杂反反应较多多，必需需经过一一段延迟迟时间才才能进入入稳定反反应期。t1时刻刻加入试试剂(体积为为V)，之之后测量量试剂空空白的吸吸光度，t2时刻刻加入样样本(体积为为S)，t3时刻刻反应稳稳定，tt4时刻刻停止对对反应进进行监测测；t22t3为延延迟时间间，t33t4为测测定时间间。单单波长反反应度（单双试试剂相同同）：RR=Att4At33双双波长反反应度：R=（t4时刻刻主波长长吸光度度t44时刻次次波长吸吸光度）-（t33时刻主主波长吸吸光度t3时刻刻次波长长吸光度度）动力学法法：又称称零级动动力学法法，指反反应速度度与底物物浓度的的零次方方成正比比

5、，也就就是与底底物浓度度无关。因此，在整个个反应过过程中，反应物物可以匀匀速地生生成某个个产物，导致被被测定溶溶液在某某一波长长下吸光光度均匀匀地减小小或增加加，减小小或增加加的速度度(A/mmin)与被测测物的活活性或浓浓度成正正比。动动力学法法也被称称为连续续监测法法；主要要用于酶酶活性的的测定。实际上上，由于于底物浓浓度不可可能足够够大，随随着反应应的进行行，底物物消耗到到一定程程度后，反应速速度不再再为零级级，因此此，零级级动力学学法是针针对于特特定时间间段而言言的；同同样，由由于血清清成份复复杂，反反应刚启启动时反反应较复复杂，杂杂反应较较多，必必需经过过一段延延迟时间间才能进进入稳

6、定定反应期期，各试试剂商对对这两段段时间有有严格规规定。t1时刻刻加入试试剂(体积为为V)，t2时刻刻加入样样本(体积为为S)，t3时刻刻反应稳稳定，ttn时刻刻停止对对反应进进行监测测；t33-t22为延迟迟时间，tn-t3为为测定时时间。单单波长反反应度（单双试试剂相同同）R（nATAT）/nT2（T）2,其其中：nnt3到tn间的的数据个个数，T时间间， A=某一时时间的吸吸光度。双波长长反应度度基本同同单波长长，只是是某一时时间的吸吸光度等等于主波波长吸光光度减去去次波长长吸光度度。第二章生化自动动化分析析方法概概要一、分析析方法分分类（一）终终点法被测物质质在反应应过程中中完全被被转

7、变为为产物，即达到到反应终终点，根根据终点点吸光度度的大小小求出被被测物浓浓度，称称为终点点法（eend esssay）。实际际上被测测物并没没有完全全被转变变，而只只是与产产物达到到一个动动态的化化学平衡衡，因此此该法称称为平衡衡法更为为恰当。从时间间-吸光光度曲线线来看，到达反反应终点点或平衡衡点时，吸光度度将不再再变化。分析仪仪通常在在反应终终点附近近连续选选择两个个吸光度度值，求求出其平平均值计计算结果果，并可可根据两两点的吸吸光度差差来判断断反应是是否到达达反应终终点。终终点法参参数设置置简单，反应时时间一般般较长，精密度度较好。终点时间间的确定定：根据时时间-吸吸光度曲曲线来确确定

8、，如如Triindeer反应应测定尿尿酸，反反应曲线线上35miin时其其吸光度度已趋向向稳定，因而可可将5mmin作作为反应应终点。根据被被测物反反应终点点，结合合干扰物物的反应应情况来来确定，如在血血清白蛋蛋白的溴溴甲酚绿绿法测定定中，白白蛋白与与溴甲酚酚绿在110s内内很快完完成反应应，之后后球蛋白白和球蛋白白与溴甲甲酚绿发发生 慢反应应，使使反应曲曲线上吸吸光度在在10ss后仍继继续缓慢慢上升，持续约约达100minn，因此此终点时时间应采采用100300s，而而不应选选择100minn。1一点点终点法法 ：在在反应到到达终点点，即在在时间-吸光度度曲线上上吸光度度不再改改变时选选择一

9、个个终点吸吸光度值值，这种种方法称称为一点点终点法法（onne ppoinnt eend esssay），其反反应曲线线见图77-3。其检测测结果的的计算公公式是：待测物物浓度CCU=（待测吸吸光度AAU试试剂空白白吸光度度AB）K。 K为校校准系数数，详见见第五节节二操作作方法。 2两点点终点法法 ：在在被测物物反应或或指示反反应尚未未开始时时，选择择第一个个吸光度度，在反反应到达达终点或或平衡时时选择第第二个吸吸光度，此两点点吸光度度之差用用于计算算结果，称为两两点终点点法（ttwo poiint endd esssayy），其其反应曲曲线见图图7-44。计算算公式为为CU=（待测测吸光度

10、度A2待测吸吸光度AA1）K。该该法能有有效地消消除溶血血（heemollysiis）、黄疸（ictteruus）和和脂浊（lippo-tturbbid）等样品品本身光光吸收（见图77-5）造成的的干扰。在单试试剂分析析加入试试剂的初初期、或或双试剂剂分析中中第二试试剂加入入之初，若指示示反应吸吸光度尚尚未明显显变化，则可在在此时选选择第一一个吸光光度，在在指示反反应终点点时选择择第二个个吸光度度，从而而设置成成两点终终点法。但指示示反应初初期吸光光度无明明显变化化的化学学反应较较少，如如单试剂剂方式测测定总蛋蛋白、白白蛋白、钙、磷磷、镁等等的终点点法分析析项目，及双试试剂方式式测定葡葡萄糖、

11、总胆固固醇、甘甘油三酯酯等的终终点法分分析项目目，因反反应初期期吸光度度已有明明显变化化，因而而均难以以用上述述方式设设置两点点终点法法。但在在双试剂剂分析中中，如果果将第一一吸光度度选择在在第二试试剂加入入前，此此时指示示反应一一般尚未未开始，则能容容易设置置两点终终点法。在此要要注意必必须将两两次读吸吸光度时时不同比比色液体体积进行行校正。目前全全自动分分析仪均均具有此此自动校校正功能能，不必必手工进进行校正正。（二）固固定时间间法指在时间间-吸光光度曲线线上选择择两个测测光点，此两点点既非反反应初始始吸光度度亦非终终点吸光光度，这这两点的的吸光度度差值用用于结果果计算，称为固固定时间间法

12、（ffixeed-ttimee esssayy），反反应曲线线见图77-6。其计算算公式与与两点终终点法相相同，为为CU=(A22-A11)K。有有时也称称此法为为两点法法。该分析方方法有助助于解决决某些反反应的非非特异性性问题。例如：苦味酸酸法测定定肌酐，反应的的最初330s内内，血清清中快反反应干扰扰物（如如微生物物、丙酮酮酸、乙乙酰乙酸酸等）能能与碱性性苦味酸酸反应；在第二二个300s时碱碱性苦味味酸主要要与肌酐酐反应，且此段段时间吸光度度曲线的的线性较较好（故故也可用用连续监监测法测测定肌酐酐）；在在801200s及其其以后，碱性苦苦味可与与蛋白质质以及其其它慢反反应干扰扰物反应应。这

13、样样选用反反应的第第二个330s为为测定时时间，既既避免了了快反应应物质的的干扰，也避免免了慢反反应物质质的影响响，使肌肌酐浓度度与吸光光度变化化呈良好好的线性性关系，有利于于提高分分析的特特异性和和准确度度。（三）连连续监测测法连续监测测法（cconttinuuouss moonittoriing esssay）又称速速率法（ratte eessaay），是在测测定酶活活性或用用酶法测测定代谢谢产物时时，连续续选取时时间-吸吸光度曲曲线中线线性期的的吸光度度值，并并以此线线性期的的单位吸吸光度变变化值（A/mmin）计算结结果，见见图7-7A和和B。所所谓线性性期就是是各点吸吸光度差差值相等

14、等，如图图7-77C所示示，图中中1及5值偏偏小，而而234，故故A1点点至A44点属线线性段。此线性性期对底底物来说说属零级级反应，期间的的A/mmin即即为酶促促反应的的初速度度，其大大小与被被测酶活活性成正正比。连连续监测测法的优优点即是是可以确确定线性性期并计计算A/mmin，根据此此值再准准确地计计算酶活活性，因因而使自自动生化化分析仪仪在酶活活性测定定方面显显著地优优于手工工法。连连续监测测法也可可用于测测定呈线线性反应应的代谢谢物浓度度，一般般是某些些基于酶酶法测定定的代谢谢物。酶酶活性（U/LL）A/mmin理论（或校准准）K值值，代谢谢物浓度度CU=A/mmin校准KK值。关

15、关于理论论K值和和校准KK值叙述述如下：1理论KK值：多用于于酶活性性测定中中，因酶酶活性尚尚无公认认的校准准品可用用，因而而根据酶酶活性的的国际单单位定义义得出酶酶活性的的计算公公式为：酶活性性 (UU/L)=A/mmin ，将将此式中中 以KK来表示示，此KK值可通通过对已已知值即即指示物物质的毫毫摩尔消消光系数数（）、反反应液总总容量（TV）、样品品容量（SV）和比色色杯光径径（d）计算后后得出，即为理理论K值值，可作作为分析析参数输输入到分分析仪中中。采用理论论K值的的前提应应当是样样品和试试剂的加加量准确确、比色色杯光径径准确、温度控控制精确确以及波波长准确确等。但但事实上上由于各各

16、型分析析仪在注注射器容容积步进进电机精精度、滤滤光片带带宽等方方面的差差异，可可造成样样品和试试剂加量量以及吸吸光度检检测的偏偏差。温温度的影影响有时时也非常常大，由由于反应应盘是半半暴露的的，因此此随着较较冷试剂剂的加入入，反应应盘中的的温度会会逐渐降降低，尽尽管开始始测定时时反应盘盘温度已已升到337C，但但在某一一项目测测定过程程的开始始阶段，温度可可能达不不到377C ，甚至仅仅35C左右右，且反反应过程程中仍有有可能上上下波动动，这对对于酶学学反应来来说影响响是很大大的。如如采用337C时的的理论KK值，将将会使测测定结果果降低，温度的的波动还还会使得得结果的的重复性性降低。当然，若

17、试剂剂在加入入反应杯杯前经试试剂臂内内加热装装置预温温，则基基本不影影响反应应盘温度度。由于摩尔尔吸光系系数受比比色杯光光径、波波长、带带宽以及及加样系系统的准准确性等等的影响响，书本本上或试试剂厂家家提供的的理论摩摩尔吸光光系数可可能与实实际所用用分析仪仪所测的的不同，因而有有必要获获得实际际的摩尔尔吸光系系数，然然后用来来计算的的K值称称为实测测K值。（1）NNADHH（NAADPHH）摩尔尔吸光系系数的测测定：NNADHH（NAADPHH）没有有标准纯纯制品，而且配配成溶液液后稳定定性又较较差，不不能直接接用NAADH 或NAADPHH标准液液来校正正仪器，须通过过有NAAD+(NADD

18、P+)参与的的反应途途径。用用已糖激激酶 (HK)或葡萄萄糖脱氢氢酶(GGD)方方法测定定葡萄糖糖时，葡葡萄糖的的消耗与与NADDH的生生成呈等等摩尔关关系。葡葡萄糖有有标准纯纯制品，又有国国家批准准文号的的葡葡糖糖标准液液。因此此，根据据公式AA=bC，已知比比色杯光光径b和和葡萄糖糖标准液液浓度，测得葡葡萄糖标标准管的的吸光度度A后便便可计算算出NAADH（NADDPH）的摩尔尔吸光系系数为 AA/bCC。假设设，葡萄萄糖标准准液浓度度为1OOmmoo1/LL(0.01mmol/L)，标准液液加入量量为3.5L，酶酶试剂加加入量为为3355L，比比色杯光光径为00.7ccm，在在3400n

19、m测测得吸光光度为00.4665，则则实测NNADHH摩尔吸吸光系数数= 64224，即在此此台分析析仪上3340nnm波长长处测得得NADDH（NNADPPH）的的摩尔吸吸光系数数为64424，而理论论上NAADH（NADDPH）的为62220。（2）色素原原酶促促产物在在4055nm波波长摩尔尔吸光系系数的测测定：有有许多酶酶底物为为人工合合成的色素原原底物物，其本本身无色色，经酶酶作用后后释放出出有色的的反应产产物，在在4055nm波波长具有有吸收峰峰。最常常用色素素原底物物及其产产物为: ALLP测定定以磷酸酸对硝基基苯酚 (4-Nittropphennyl phoosphhatee，

20、4-NPPP)为底底物，经经酶作用用后释放放出黄色色的对硝硝基苯酚酚(4-Nittropphennol，4-NNP)，GGTT测定以以-L-谷氨酰酰对硝基基苯胺(-L-Gluutammyl-p-nnitrroanniliide)或-L-谷氨酰酰-3-羟基-对硝基基苯胺(-L-Gluutammyl-3-ccarbboxyyl-pp-niitrooan)为底物物，经酶酶作用后后释放出出黄色的的对硝基基苯胺(p-NNitrroanniliine，4-NNA)或或对硝基基-5-氨基苯苯甲酸(2-aaminno-nnitrrobeenzooicaacidd， AANBAA)。对对硝基苯苯酚的摩摩尔吸光光

21、系数为为187700(4055nm)，对硝硝基苯胺胺的摩尔尔吸光系系数为998700(4005nmm)，对对硝基-5-氨氨基苯甲甲酸的摩摩尔吸光光系数为为94990(4405nnm)。下面是是对硝基基苯酚的的摩尔吸吸光系数数测定方方法。试剂： 4-NP标标准储存存液(11Ommmo1/L)。 4-NP标标准应用用液(22.5mmmo11/L，以0.84mmol/L AAMP缓缓冲液稀稀释而成成)。 底物物缓冲液液(l55mmool/LL 4-NPPP配于00.844moll/L AMPP-HCCL缓冲冲液中，37,pHH l00.099土0.02)。测定方法法：4-NP标标准液加加入量为为5L

22、，底底物缓冲冲液加入入量为3350L，波波长4005nmm，光径径0.77cm，温度337，测定定得吸光光度为AA1；另另用蒸馏馏水代替替4-NNP标准准液，按按上述方方法测定定其吸光光度为AA2，44-NPP标准液液吸光度度A= A1- A22，若测测得A为00.4660，则则实测4-NP摩摩尔吸光光系数 11866622校准准K值酶活性性校准品品经校准准操作后后由分析析仪自动动计算得得出。在在进行酶酶学测定定时，如如果分析析条件的的变化如如温度、样品试试剂加量量和吸光光度检测测偏差可可同等程程度地影影响校准准物和待待测样品品，则使使用校准准品能进进行补偿偿。一般般来说以以使用校校准K值值为

23、好，但必须须有两个个先决条条件：必须使使用配套套的试剂剂；必须使使用配套套的高质质量的校校准品，该校准准品应具具有溯源源性。使使用与该该分析仪仪配套的的酶活性性校准品品也可得得到较好好的酶活活性测定定结果。关于酶酶活性标标准品，欧洲标标准局（BCRR）和美美国国家家标准技技术研究究院（NNISTT）均发发表了人人血清基基质的酶酶活性标标准物，但目前前尚无公公认的标标准（校校准）品品问世。（四）透透射比浊浊法 抗原与相相应的抗抗体结合合形成的的免疫复复合物，在反应应液中具具有一定定的浊度度，可由由一般分分光光度度法进行行透射比比浊（ttrannsmiissiion turrbiddimeetry

24、y）测定定，可用用于某些些蛋白质质和药物物浓度等等的测定定。该法法须做多多点校准准，再经经非线性性回归，求出抗抗原或抗抗体的含含量。使使用散射射比浊法法（sccattter turrbiddimeetryy）能更更加准确确快速地地检测抗抗原抗体体形成浊浊度的大大小或其其速度，目前专专用的特特定蛋白白分析仪仪可做此此法检测测。有关关免疫比比浊法原原理详见见第二章章。二、常用用生化检检测项目目分析方方法举例例1终点法法检测常用的的有总胆胆红素（氧化法法或重氮氮法）、结合胆胆红素（氧化法法或重氮氮法）、血清总总蛋白（双缩脲脲法）、血清白白蛋白（溴甲酚酚氯法）、总胆胆汁酸（酶法）、葡萄萄糖（葡葡萄糖氧

25、氧化酶法法）、尿尿酸（尿尿酸酶法法）、总总胆固醇醇（胆固固醇氧化化酶法）、甘油油三酯（磷酸甘甘油氧化化酶酶法法）、高高密度脂脂蛋白胆胆固醇（直接测测定法）、钙（偶氮砷砷法）、磷（紫紫外法）、镁（二甲苯苯胺蓝法法）等。以上项项目中，除钙、磷和镁镁基本上上还使用用单试剂剂方式分分析因而而采用一一点终点点法外，其它测测定项目目都可使使用双试试剂故能能选用两两点终点点法，包包括总蛋蛋白、白白蛋白测测定均已已有双试试剂可用用。2固定时时间法苦味酸酸法测定定肌酐采采用此法法。3连续监监测法对于酶酶活性测测定一般般应选用用连续监监测法，如丙氨氨酸氨基基转移酶酶、天冬冬氨酸氨氨基转移移酶、乳乳酸脱氢氢酶、碱碱

26、性磷酸酸酶、谷氨氨氨酰基转转移酶、淀粉酶酶和肌酸酸激酶等等。一些些代谢物物酶法测测定的项项目如己己糖激酶酶法测定定葡萄糖糖、脲酶酶偶联法法测定尿尿素等，也可用用连续监监测法。4透射射比浊法法透射射比浊法法可用于于测定产产生浊度度反应的的项目，多数属属免疫比比浊法，载脂蛋蛋白、免免疫球蛋蛋白、补补体、抗抗O、类风风湿因子子，以及及血清中中的其他他蛋白质质如前白白蛋白、结合珠珠蛋白、转铁蛋蛋白等均均可用此此法。第三章常用生化化检测项项目分析析方法举举例及参参数设置置一、常用用生化检检测项目目分析方方法举例例1终点点法检测测常用用的有总总胆红素素（氧化化法或重重氮法）、结合合胆红素素（氧化化法或重重

27、氮法）、血清清总蛋白白（双缩缩脲法）、血清清白蛋白白（溴甲甲酚氯法法）、总总胆汁酸酸（酶法法）、葡葡萄糖（葡萄糖糖氧化酶酶法）、尿酸（尿酸酶酶法）、总胆固固醇（胆胆固醇氧氧化酶法法）、甘甘油三酯酯（磷酸酸甘油氧氧化酶酶酶法）、高密度度脂蛋白白胆固醇醇（直接接测定法法）、钙钙（偶氮氮砷法）、磷（紫紫外法）、镁（二甲苯苯胺蓝法法）等。以上项项目中，除钙、磷和镁镁基本上上还使用用单试剂剂方式分分析因而而采用一一点终点点法外，其它测测定项目目都可使使用双试试剂故能能选用两两点终点点法，包包括总蛋蛋白、白白蛋白测测定均已已有双试试剂可用用。2固定定时间法法苦味味酸法测测定肌酐酐采用此此法。3连续续监测法

28、法对于于酶活性性测定一一般应选选用连续续监测法法，如丙丙氨酸氨氨基转移移酶、天天冬氨酸酸氨基转转移酶、乳酸脱脱氢酶、碱性磷磷酸酶、谷氨氨氨酰基转转移酶、淀粉酶酶和肌酸酸激酶等等。一些些代谢物物酶法测测定的项项目如己己糖激酶酶法测定定葡萄糖糖、脲酶酶偶联法法测定尿尿素等，也可用用连续监监测法。4透射射比浊法法透射射比浊法法可用于于测定产产生浊度度反应的的项目，多数属属免疫比比浊法，载脂蛋蛋白、免免疫球蛋蛋白、补补体、抗抗O、类风风湿因子子，以及及血清中中的其他他蛋白质质如前白白蛋白、结合珠珠蛋白、转铁蛋蛋白等均均可用此此法。二、分析析参数设设置分析仪的的一些通通用操作作步骤如如取样、冲洗、吸光度

29、度检测、数据处处理等，其程序序均已经经固化在在存储器器里，用用户不能能修改。各种测测定项目目的分析析参数（anaalyssispparaamette）大大部分也也已设计计好，存存于磁盘盘中，供供用户使使用；目目前大多多数生化化分析仪仪为开放放式，用用户可以以更改这这些参数数。生化化分析仪仪一般另另外留一一些检测测项目的的空白通通道，由由用户自自己设定定分析参参数。因因此必须须理解各各参数的的确切意意义。一、分析析参数介介绍（一）必必选分析析参数这类参数数是分析析仪检测测的前提提条件，没有这这些参数数无法进进行检测测。1试验验名称试试验名称称（teest codde）是是指测定定项目的的标示符符

30、，常以以项目的的英文缩缩写来表表示。2方法法类型（也称反反应模式式）方法法类型（asssay）有终点点法、两两点法、连续监监测法等等，根据据被检物物质的检检测方法法原理选选择其中中一种反反应类型型。3反应应温度一一般有330、37可供选选择，通通常固定定为377。4主波波长主波波长（pprimmaryy waavellenggth）是指定定一个与与被测物物质反应应产物的的光吸收收有关的的波长。5次波波长次波波长（ssecoondaary wavveleengtth）是是在使用用双波长长时，要要指定一一个与主主波长、干扰物物质光吸吸收有关关的波长长。6反应应方向反反应方向向（reespoonse

31、e diirecctioon）有有正向反反应和负负向反应应两种，吸光度度增加为为正向反反应，吸吸光度下下降为负负向反应应。7样品品量样品品量（ssampplinng vvoluum）一一般是22l35l，以0.1l步进，个别分分析仪最最少能达达到1.6l。可设设置常量量、减量量和增量量。8第一一试剂量量第一试试剂量（firrst reggenggt vvoluum）一一般是2203000l，以1l步进。9第二二试剂量量第二试试剂量（seccondd reegenngt vollum）一般也也是2003000l，以1l步进。10总总反应容容量总反反应容量量（tootall reeacttingg

32、 voolumm）在不不同的分分析仪有有一个不不同的规规定范围围，一般般是18803500l，个别别仪器能能减少至至1200l。总反反应容量量太少无无法进行行吸光度度测定。11孵孵育时间间孵育时时间（iincuubatte ttimee）在终终点法是是样品与与试剂混混匀开始始至反应应终点为为止的时时间，在在两点法法是第一一个吸光光度选择择点开始始至第二二个吸光光度选择择点为止止的时间间。12延延迟时间间延迟时时间（ddelaay ttimee）在连连续监测测法中样样品与反反应试剂剂（第二二试剂）混匀开开始至连连续监测测期第一一个吸光光度选择择点之间间的时间间。13连连续监测测时间连连续监测测时

33、间（conntinnuouus mmoniitorringg tiime）在延迟迟时间之之后即开开始，一一般为6601200s，不不少于44个吸光光度检测测点（33个吸光光度变化化值）。14校校准液个个数及浓浓度校准准曲线线线性好并并通过坐坐标零点点的，可可采用一一个校准准液（ccaliibraatorr）；线线性好但但不通过过坐标零零点，应应使用两两个校准准液；对对于校准准曲线呈呈非线性性者，必必须使用用两个以以上校准准液。每每一个校校准液都都要有一一个合适适的浓度度。15校校准K值或理理论K值通过校校准得到到的K值为校校准K值（caalibbratte ccoeffficciennt）或或

34、由计算算得出的的K值为理理论K值。16线线性范围围即方法法的线性性范围（linnearrityy raangee），超超过此范范围应增增加样品品量或减减少样品品量重测测。与试试剂/样品比比值有关关。17小小数点位位数检测测结果的的小数点点位数（deccimaal ppoinnt ddigiit）。（二）备备选分析析参数这类分析析参数与与检测结结果的准准确性有有关，一一般来说说不设置置这类分分析参数数，分析析仪也能能检测出出结果，但若样样品中待待测物浓浓度太高高等，检检测结果果可能不不准确。1样品品预稀释释设置样样品量、稀释剂剂量和稀稀释后样样品量三三个数值值，便可可在分析析前自动动对样品品进行

35、高高倍稀释释。2底物物耗尽值值底物耗耗尽值（subbstrratee exxhauust limmit）在负反反应的酶酶活性测测定中，可设置置此参数数，以规规定一个个吸光度度下降限限。若低低于此限限时底物物已太少少，不足足以维持持零级反反应而导导致检测测结果不不准确。3前区区检查免免疫比浊浊法中应应用，以以判断是是否有抗抗原过剩剩。将终终点法最最后两个个吸光度度值的差差别（A）设置置一个限限值，如如果后一一点的吸吸光度比比前一点点低，表表示已有有抗原过过剩，应应稀释样样品后重重测。4试剂剂空白吸吸光度范范围超过过此设定定范围表表示试剂剂已变质质，应更更换合格格试剂。5试剂剂空白速速率连续续监测

36、法法中使用用，是试试剂本身身在监测测过程中中没有化化学反应应时的变变化速率率。6方法法学补偿偿系数用用于校准准不同分分析方法法间测定定结果的的一致性性，有斜斜率和截截距两个个参数。7参考考值范围围对超过过此范围围的测定定结果，仪器会会打印出出提示。（三）某某些参数数的特殊殊意义1最小小样品量量最小样样品量是是指分析析仪进样样针能在在规定的的误差范范围内吸吸取的最最小样品品量。一一般分析析仪的最最小样品品量是22l，目前前也有小小至1.6l的。在在样品含含高浓度度代谢产产物或高高活性酶酶浓度的的情况下下往往需需采用分分析仪的的最小样样品量作作为减量量参数，从而使使分析仪仪检测范范围（与与线性范范

37、围不同同）的上上限得以以扩大。2最大大试剂量量方法灵灵敏度很很高而线线性上限限低的检检测项目目，如血血清白蛋蛋白的溴溴甲酚氯氯法测定定，以往往手工法法操作时时样品量量10l，试剂剂量4mml，这这样试剂剂量/样品量量比例（R/SS）为2000，线线性上限限则为660g/L。此此法移植植到分析析仪上后后，R/S却很很难达到到2000，致使使线性上上限变低低。因此此对这类类检测项项目最大大试剂量量非常重重要。3弹性性速率在在酶活性性测定中中，当酶酶活性太太高，在在连续监监测期中中已不呈呈线性反反应时，有些仪仪器具有有弹性速速率（fflexxratte）功功能，能能自动选选择反应应曲线上上连续监监测

38、期中中仍呈线线性的吸吸光度数数据计算算结果，使酶活活性测定定的线性性范围得得以扩大大。如AAST可可从10000UU/L扩扩展至440000U/LL，从而而减少稀稀释及重重测次数数、降低低成本。4试剂剂空白速速率当样样品中存存在胆红红素时，胆红素素对碱性性苦味酸酸速率法法或两点点法测定定肌酐有有负干扰扰。因为为胆红素素在肌酐酐检测的的波长5505nnm有较较高光吸吸收，而而且胆红红素在碱碱性环境境中可被被氧化转转变，因因而在肌肌酐反应应过程中中胆红素素的光吸吸收呈下下降趋势势。若在在加入第第一试剂剂后一段段时间内内设置试试剂空白白速率，因为此此段中苦苦味酸尚尚未与肌肌酐反应应，而胆胆红素在在第

39、一试试剂的碱碱性环境境中已同同样被氧氧化转变变，因而而以第二二试剂加加入后的的速率变变化，减减去试剂剂空白速速率变化化，便可可消除胆胆红素的的负干扰扰，见图图7-88。二、单波波长和双双波长方方式（一）概概念采用一个个波长检检测物质质的光吸吸收强度度的方式式称为单单波长(monno-wwaveelenngthh)方式式。当反反应液中中含有一一种组分分，或在在混合反反应液中中待测组组分的吸吸收峰与与其它共共存物质质的吸收收波长无无重叠时时，可以以选用。在吸光光度检测测中，使使用一个个主波长长和一个个次波长长的称双双波长方方式。当当反应液液中存在在干扰物物的较大大吸收、从而影影响测定定结果的的准确

40、性性时，采采用双波波长方式式更好。（二）双双波长的的作用双波长(di-wavveleengtth)测测定优点点是消除噪噪音干扰扰;减少杂杂散光影影响;减少样样品本身身光吸收收的干扰扰。从光光源，到到比色杯杯、单色色器、检检测器的的整个光光路系统统中，均均存在着着随时间间发生变变化的不不稳定的的检测信信号，即即噪音，而双波波长检测测是同时时进行的的，两种种波长检检测产生生的噪音音基本上上相同，因而能能消除噪噪音干扰扰。当样样品中存存在非化化学反应应的干扰扰物如甘甘油三酯酯、血红红蛋白、胆红素素等时，会产生生非特异异性的光光吸收，而干扰扰测定结结果的准准确性。采用双双波长方方式测定定可以部部分消除

41、除这类干干扰，提提高检测测的准确确性。（三）次次波长的的确定方方法当被测物物的主波波长确定定之后，再选择择次波长长。如根根据甘油油三酯等等干扰物物吸收光光谱特征征，选择择次波长长，使干干扰物在在主、次次波长处处有尽可可能相同同的光吸吸收值，而被测测物在主主、次波波长处的的光吸收收值应有有较大的的差异。一般来来说，次次波长应应大于主主波长1100nnm。以以主波长长与次波波长吸光光度差来来计算结结果。（四）双双波长的的具体应应用对于某些些反应速速度快且且无法设设置为两两点终点点法的分分析项目目，尤其其是单试试剂分析析中，可可以利用用双波长长的方式式来部分分消除样样品本身身的光吸吸收干扰扰。目前前

42、用单试试剂法测测定的项项目应用用双波长长的为血血清总蛋蛋白（双双缩脲法法）主波波长5000nmm，次波波长5776nmm；血清清白蛋白白（溴甲甲酚氯法法）主、次波长长分别为为6000和7000nm；钙（偶偶氮砷法）主主、次波波长分别别为 6660、7700nm；磷（紫紫外比色色法）主主、次波波长为3340、4055nm，镁（二二甲苯胺胺蓝法）主、次次波长为为5055和 6000nmm。三、单试试剂和双双试剂方方式反应过程程中只加加一次试试剂称单单试剂方方式，加加两次试试剂便为为双试剂剂方式。目前的的生化分分析仪大大多可用用双试剂剂方式分分析，其其优点是是：可提高高试剂的的稳定性性，多数数双试剂

43、剂混合成成单一工工作试剂剂时，其其稳定时时间缩短短；能设置置两点终终点法，来消除除来自样样品本身身的光吸吸收干扰扰；在某些些项目检检测时能能消除非非特异性性化学反反应的干干扰。如如血清AALT测测定，血血清中的的内源性性丙酮酸酸及其它它酮酸也也可与试试剂中的的指示酶酶（乳酸酸脱氢酶酶）起反反应，使使结果偏偏高。若若先加入入缺乏-酮戊二二酸的第第一试剂剂，使其其它酮酸酸与指示示酶反应应之后再再加入含含有-酮戊二二酸的第第二试剂剂，启动动真正的的ALTT酶促反反应生成成丙酮酸酸，而丙丙酮酸与与乳酸脱脱氢酶的的反应消消耗的NNAD能真正正反映AALT的的活性，从而消消除以上上副反应应的影响响。四、测

44、定定过程的的自动监监测各种自动动生化分分析仪或或多或少少都具有有对测定定过程进进行各种种监测的的功能，以便在在没有人人监督化学反反应的情情况下提提高检测测的准确确性。高高档分析析仪的监监测功能能更强。1试剂剂空白监监测每种种试剂都都有一定定的空白白吸光度度范围，试剂空空白吸光光度的改改变往往往提示着着该试剂剂的变质质：如利利用Trrindder反反应为原原理的检检测试剂剂会因酚酚被氧化化为醌而而变为红红色；碱碱性磷酸酸酶、谷氨氨酰转移移酶、淀淀粉酶等等检测试试剂会因因基质分分解出硝硝基酚或或硝基苯苯胺而变变黄；有有些试剂剂久置后后变浑浊浊。这些些情况均均可使空空白吸光光度升高高。丙氨氨酸氨基基

45、转移酶酶、天冬冬氨酸氨氨基转移移酶等负负反应检检测项目目，其试试剂在放放置过程程中空白白吸光度度会因NNADHH自行氧氧化为NNAD+而下降降等。试剂空白白的测定定方法有有两种：每瓶试试剂在使使用前通通过对试试剂空白白校准来来确定试试剂空白白吸光度度，这种种方式适适用于先先取样品品后加试试剂的分分析仪。每个样样品测定定前均检检测试剂剂空白吸吸光度，适用于于先加试试剂后取取样品的的分析仪仪。2试剂剂空白变变化速率率监测一一些酶试试剂在反反应温度度下不稳稳定，其其空白吸吸光度可可随着时时间逐渐渐发生变变化，这这种变化化的主要要原因与与工具酶酶或辅酶酶的纯度度有关，且因试试剂的组组成和生生产厂家家的

46、不同同而不同同。这种种变化会会影响测测定结果果的准确确性，一一般使结结果偏高高。如果果设置此此项监测测，分析析仪在结结果计算算时会自自动减去去试剂空空白变化化速率。在以监监测NAAD（P）H减少为为指示反反应的酶酶活性测测定中，空白速速率可监监测并消消除由NNADHH自身氧氧化所造造成的吸吸光度下下降；在在色素原原为底物物的酶活活性测定定中，空空白速率率可监测测并消除除底物自自身分解解造成的的吸光度度升高。有关空空白速率率监测在在胆红素素对碱性性苦味酸酸速率法法测定肌肌酐负干干扰消除除中的作作用，已已如前述述。3样品品信息监监测由于于样品的的溶血、脂浊、黄疸会会对测定定结果产产生非化化学反应应

47、的干扰扰。根据据溶血、脂浊、黄疸的的光谱吸吸收特性性，用双双波长或或多波长长检测其其性质和和程度，一般是是测定样样品在6600nnm5700nm、7000nm/6600nm和和5055nm/4800nm吸吸光度比比值的大大小来分分别判断断样品溶溶血、脂脂浊和黄黄疸程度度。然后后在结果果计算时时自动减减去这部部分干扰扰，这将将有利于于提高分分析结果果的可靠靠性。4结果果可靠性性监测（1）终终点监测测：终点点法测定定要判断断所选的的测光点点是否到到达终点点或平衡衡点。一一些分析析仪在所所选终点点后再选选一个测测光点，比较这这两点吸吸光度的的差异来来判断反反应是否否到达终终点。（2）线线性期监监测：

48、连连续监测测法选择择时间吸光度度反应曲曲线上的的线性期期来计算算酶活性性或被测测物浓度度，因此此仪器要要确定此此连续监监测期是是否呈线线性。其其监测方方法为将连续续监测到到的各吸吸光度值值进行线线性回归归，计算算出各点点的方差差，根据据方差值值的大小小来判断断是否呈呈线性；取连续续监测期期开始若若干点的的变化速速率与连连续监测测期最后后若干点点的变化化速率进进行比较较，来判判断是否否为线性性期。5底物物消耗的的监测在在连续监监测法测测定酶活活性时，如果在在监测期期内吸光光度上升升或下降降超过其其底物耗耗尽值，则说明明该样品品酶活性性非常高高，底物物将被耗耗尽，监监测期的的吸光度度将偏离离线性，

49、使测定定结果不不可靠。此时不不打印结结果或打打印结果果同时也也打印出出底物耗耗尽提示示，该样样品应稀稀释一定定的倍数数重新测测定。此此监测对对于采用用负反应应分析酶酶活性的的方法甚甚为重要要。见图图7-996方法法线性范范围监测测每种待待测物分分析都有有一个可可测定的的浓度或或活性范范围，样样品结果果若超过过此范围围，分析析仪将显显示测定定结果超超过线性性范围的的提示，多数分分析仪会会自动将将样品减减量或增增量重新新测定。第四章标准品和和校准品品传统的临临床检验验，要使使检验结结果可靠靠或有依依据，往往往有一一个标准准品(SStanndarrd)。以临床床化学检检验的比比色测定定为例，常作三三

50、个检测测：空白白、标准准、测定定。用空空白液调调整吸光光度为零零，读出出测定比比色液和和标准比比色液的的吸光度度，分别别为Ass和Au；已已知标准准液浓度度为Css。在一一定范围围内，某某分析物物浓度和和吸光度度呈良好好比例关关系。为为了克服服纯标准准液和病病人样品品间的基基体差异异，200年前开开始引用用具有与与病人样样品基体体相似的的校准品品替代标标准品，用于日日常工作作。由于于以往在在使用标标准品时时不强调调它的专专用性，国内在在应用校校准品时时忽略了了它的专专用性。任何方方法或仪仪器、试试剂使用用一个校校准品，严重影影响检验验质量。一、标准准液的定定值一般而言言，检验验工作使使用的标标

51、准品属属应用标标准。配配制或供供应这类类标准品品的实验验室或厂厂商具有有符合质质量标准准的纯品品。称取取一定量量的纯品品，然后后将其溶溶解，在在容量瓶瓶内用溶溶剂稀释释至容积积刻度，混匀，标准液液配制完完成。由由称量法法获得的的称量值值和容量量法配制制的容积积，计算算出该标标准品浓浓度。检检定部门门抽样测测定，结结果在规规定范围围内属合合格。即即使测定定检定结结果在范范围的上上、下限限，也不不能将实实测值作作为标准准值。因因为测定定值的可可靠性取取决于检检定方法法，一般般的分析析方法的的可靠性性不如分分析化学学公认的的称量法法和容量量法。所所以标准准品的定定值由称称量和容容积计算算确定。检定不

52、不合格即即报废，决不可可将实测测值替代代修正。二、校准准品的定定值1校准准值随方方法而异异如前述，由于纯纯标准液液和新鲜鲜病人标标本间的的基体差差异，以以标准液液标化常常用方法法后，常常用方法法检测病病人标本本的结果果和参考考方法结结果的可可比性很很差。为了克服服基体效效应，推推荐使用用校准品品。校准准品的大大多来源源为人的的样品混混合物，如混合合血清。本身内内含被检检分析物物，制备备时可添添加某些些分析物物增加含含量。校校准品中中被检分分析物的的含量无无法由称称量法和和容量法法确定，只能倚倚赖于分分析方法法。校准准品的校校准值必必须取决决于分析析方法或或检测系系列。2新鲜鲜病人标标本是最最佳

53、校准准品由于所有有校准品品都是处处理过的的样品，和新鲜鲜病人标标本有着着基体差差异。若若使用公公认的参参考方法法去标化化测定校校准品，测定程程序是严严密的，测定值值是可靠靠的。但但使用该该测定值值去校准准常规的的检测系系列时，校准品品中被检检分析物物参与反反应时的的表现明明显不同同于新鲜鲜病人标标本，不不能将参参考方法法系列的的准确度度通过校校准品传传递给病病人标本本。须明明确的，所有用用于检验验中的检检测方法法、仪器器、试剂剂等都是是用来检检测病人人新鲜标标本的，不是用用来检测测校准品品这样的的处理过过样品。如果先先用公认认的参考考方法检检测病人人标本，再以具具有参考考值的病病人标本本去校准

54、准某检测测系列（包括方方法、试试剂、仪仪器），此时该该检测系系列再检检测其他他新鲜病病人标本本时，这这些病人人标本结结果的溯溯源性可可上溯至至公认的的参考方方法。也也即用新新鲜病人人标本是是校准检检测系列列的最佳佳校准品品。用这这种方式式校准，能使同同一个检检测系列列在不同同实验室室检测新新鲜病人人标本时时，检验验结果在在实验室室间具可可比性。一些大大公司正正是按照照这样的的认识为为校准品品定值。三、原则上上，以具具有参考考值的新新鲜病人人标本去去校准某某检测系系列（包包括方法法、试剂剂、仪器器）后，检测系系列再去去检测候候选的校校准品（处理过过），得得到的检检测值为为初始校校准值。以初始始校

55、准值值反过来来再校准准组合的的检测系系列后，该检测测系列又又去检测测病人的的新鲜标标本。观观察病人人标本的的检测值值是否和和参考方方法的测测定值具具良好的的可比性性。实践践说明，只有不不断地调调整校准准值，直直至用该该校准值值校准指指定的检检测系列列（加上上具有校校准值的的校准品品，即组组合成检检测系统统）后，检测系系统再检检测病人人标本，得到的的测定值值和病人人标本的的参考方方法测定定值具有有满意的的可比性性（测定定值和参参考值间间的偏倚倚2%）。此时，校准品品的校准准值可以以确认。1校准准值不是是测定值值，是纠纠正的调调整值 (Coorreecteed VValuue)厂商的校校准品定定值

56、方案案极为严严密。为为了便于于说明问问题，以以某公司司的定值值方案为为例，定定值的校校准品是是人血清清。1）准备备一批血血清样品品，内含含被检分分析物含含量不同同，可反反映所需需的病人人结果可可报告范范围。将将它们离离心、过过滤，分分装后深深低温保保存。由由参考实实验室用用公认的的参考方方法和标标准品或或参考品品，对这这些血清清检测定定值。这这些血清清是公司司的一级级“参考品品”，参考考方法对对血清的的定值犹犹如参考考值，是是确定校校准品校校准值的的依据。2）制备备一大批批侯选校校准品。由参考考实验室室也为之之定值。邀请多多家具有有指定的的相同型型号仪器器的实验验室（包包括公司司的实验验室）参

57、参与工作作。指定定使用公公司某型型号的试试剂盒（批号任任意）及及检测程程序。校校准目标标是：公公司提供供的仪器器、试剂剂和方法法系列（加上校校准品即即为检测测系统）对病人人样品的的检测结结果和参参考方法法对病人人样品检检测结果果具可比比性。首首先，用用侯选校校准品的的定值对对检测系系列校准准后，检检测一级级参考品品的血清清。由于于侯选校校准品和和病人样样品间的的基体差差异，以以它的参参考实验验室定值值对检测测系统校校准后，检测系系统对病病人样品品的检测测结果必必然和这这些血清清已有的的参考值值有偏倚倚。要使使组成的的检测系系统实现现校准目目标，唯唯一方法法是调整整侯选校校准品的的校准值值。经反

58、反复检测测和调整整、统计计，最终终实现校校准目标标时的校校准值，为该校校准品的的定值。这个校校准品是是公司的的一级校校准品，是公司司内部具具有可溯溯源性的的第一代代的校准准品，不不外售。3）以后后公司在在生产供供应给客客户的校校准品时时，生产产质量规规格相同同于一级级校准品品，定值值方案也也相同于于上述步步骤；但但此时分分发给各各实验室室的一级级校准品品已具有有了真正正校准该该检测系系统的校校准值。各实验验室的检检测系统统被一级级校准品品校准后后，检测测一级参参考品血血清和新新校准品品。首先先确认各各系统对对一级参参考品血血清检测测结果和和原有的的血清参参考值具具良好的的可比性性，说明明一级校

59、校准品有有效。再再以新校校准品的的定值去去校准各各系统后后，各系系统再检检测一级级参考品品血清和和一级校校准品，观察检检测结果果。若能能实现校校准目标标，校准准确认，则新校校准品的的定值为为它的校校准值。在实践践中血清清结果往往往仍然然出现偏偏倚，必必须对新新校准品品的定值值略作调调整，反反复检测测，直至至实现校校准目标标，调整整的最佳佳值为该该批校准准品的校校准值。此时这这批校准准品可供供市售。4）为使使公司供供应的各各批校准准品间具具可比性性，以后后对每批批新校准准品定值值时，须须使用已已上市的的校准品品、即将将过期的的校准品品、以及及即将上上市的校校准品当当作控制制品，随随同一级级校准品

60、品和一级级参考品品血清一一起被检检测。它它们的检检测结果果须和原原校准值值的偏倚倚小于某某规定的的范围（如不大大于2%），方方可认可可这批校校准品的的校准值值（这即即为校准准认可的的要求）。5）用这这样的程程序制备备的校准准品，专专用于指指定的某某公司型型号的仪仪器、试试剂、方方法和检检测程序序组成的的检测系系统。因因此校准准品只能能为这样样的系统统服务，起校准准作用，不能对对其他系系统作校校准。2具多多个校准准值的校校准品专门供应应试剂盒盒的厂商商，为了了使他们们的试剂剂盒用于于各种类类型、型型号的仪仪器和方方法，也也同时为为客户提提供校准准品。说说明书告告诉客户户，使用用他们的的校准品品，