蛋白质表达和抗体制备

1、蛋白质表示第1页惯用蛋白表示系统(host) 原核：大肠杆菌。真核：酵母、昆虫、哺乳动物、植物。第2页大肠杆菌表示系统 大肠杆菌是基因工程研究中采取最多原核表示体系。优越性：对大肠杆菌基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表示调控机理已经有了深刻了解；商品化载体和菌株种类非常齐全；表示效率高；易培养，成本低。缺点：因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性包含体；蛋白质不能糖基化；其内毒素极难除去。 第3页酵母表示系统 优越性：蛋白可糖基化，有相对正确天然结构，可很好生产分泌型蛋白；表示载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源序列，因而比较轻易整合入酵母染色体中，实现高效率表示；表示载体都为

2、E.coli/Pichia Pastoris穿梭载体，可在取得克隆后采取E.coli细胞大量扩增。易培养，成本低,可高密度发酵。缺点：糖基化与哺乳动物有所差异；培养上清多糖浓度高，不利于纯化。第4页昆虫细胞表示系统 利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表示外源蛋白是当前较为流行表示方式。优越性：重组蛋白含有完整生物学功效，如蛋白正确折叠、二硫键搭配；可容纳较大片段外源DNA插入，所以是表示大片段DNA理想载体；可进行分泌表示。缺点：糖基化与哺乳动物有所差异；表示量有限；作为药品宿主细胞未被FDA认可； 培养成本高。第5页哺乳动物细胞表示系统 哺乳动物细胞惯用于表示高活性人源重组蛋白。优越性：糖基化

3、与人源蛋白一致；能表示天然结构完整蛋白，活性很高；可进行分泌表示。缺点：表示量低；培养成本很高，操作繁琐。第6页植物表示系统优越性：能够表示来自动物、细菌、病毒以及植物本身蛋白质。易于大规模培养和生产。在基因表示与修饰及安全性方面有尤其优势。缺点：不易提取与纯化第7页Factors in E.coli protein expressionVectorStrainGrowth conditions第8页原核表示载体众多，惯用有pET(T7 promoter)、pQE(T5 promoter)、pGEX(GST融合表示)等。各载体适应菌株也不尽相同pET(BL21(DE3)、pQE(M15,JM1

4、09)、pGEX(BL21)。对于我们来说，最惯用和最需掌握是pET表示系统表示载体(Vector) 第9页Expression plasmid features第10页Lac operon第11页Induction of expression第12页原核表示宿主菌名称特征用途抗性DH5带有recA endA突变克隆菌株，因为DH5含有deoR变异，能够作为较大质粒宿主菌使用。惯用质粒抽提工程菌株, 可用于蓝白斑筛选判别重组菌株。无BL21lon和ompT蛋白酶缺点型用于PGEX载体构建质粒蛋白表示无BL21 (DE3)lon和ompT蛋白酶缺点型，含有lacI抑制基因和位于lacUV5开启子

5、下T7 RNA 聚合酶基因用于含有T7pET系列载体构建质粒蛋白表示无BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)细胞基础上，含有额外拷贝argU和proL基因处理了表示富含AT基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)细胞基础上，含有额外拷贝argU、ileY和leuW tRNA基因处理了表示富含AT基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-plysS带有能够与pET共存、编码T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶天然抑制物）质粒。 pLysS 菌株在被诱导前T7 RNA聚合酶基础表示被抑制，这么能够使表示会影响宿主细胞生长和活力重组体在宿主中更稳定。带

6、有pLacI质粒宿主菌产生额外抑制pETBlue和pTriEx载体基础表示lac阻遏蛋白更严格本底表示控制，适合于毒性蛋白和非毒性蛋白表示。氯霉素BL21(DE3)- Rosetta-gami（Rosetta-gami）携带pRARE2质粒BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密码子对应tRNA，提升外源基因、尤其是真核基因在原核系统中表示水平，又含有thioredoxin reductase(trxB)和glutathione reductase(gor)两条主要还原路径双突变菌株，显著提升细胞中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性

7、表示补充7种稀有密码子，促进蛋白可溶性及表示活性卡那霉素、氯霉素、四环素Rosetta -Blue带有recA endA lacIq突变克隆菌株,高蛋白表示, 补充大肠杆菌缺乏AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA六种稀有密码子对应tRNA。补充稀有密码子，提升外源基因、尤其是真核基因在原核系统中表示水平氯霉素第13页全部 B 型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta及Tuner都缺乏纯化过程中降解蛋白lon蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶。所以，目标蛋白在这些菌株中稳定性要高于带有这些蛋白酶菌株。BL21(DE3)是用得最多表示菌AD494 (D

8、E3)和BL21trxB (DE3)含有trxB 突变，而Origami (DE3)，Origami B (DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株带有trxB 和gor双突变。拥有trxB 和gor突变菌株比单具 trxB 突变菌株更有可能促进二硫键形成，使蛋白可溶性更加好，活性更高多数氨基酸有不只一个密码子，而不一样生物使用这61 种密码子偏好性不一样。每种细胞里，tRNA种类和数量直接反应了其mRNA 使用密码子种类和数量偏好性。当外源目标基因mRNA 在E.coli里过表示，因为密码子偏爱性不一样，会因为缺乏某种或某几个tRNA，直接造成翻译终止或错误。tRNA不足会造成翻译停

9、顿，早期翻译停顿，移码突变，和氨基酸错掺等问题。Rosetta菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子真核蛋白表示菌株。经提升稀有tRNA 水平，这些蛋白表示会大幅度提升。第14页 表示条件培养基抗生素诱导剂诱导温度诱导时机诱导时间第15页载体对表示影响pET32,BL21(DE3),表示蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表示蛋白:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD)N I I I M I p s p s M N I S PU:Uninduced crude extractI:Crude extract after i

10、nducedS:Lysis supertanantP:Lysis precipitation第16页0.1mM IPTG,incubate for 16h at 160.1mM IPTG,incubate for 3h at 37 N I S P N I S P表示条件对表示影响pET21,BL21(DE3)-RIL,表示蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)U:Uninduced crude extractI:Crude extract after inducedS:Lysis supertanantP:Lysis precipitation第17页 增加可溶性和折叠降低蛋白合成速率。

11、温度。裂解缓冲液性质。融合标签二硫键第18页pET载体E.coli表示蛋白流程制备pET载体制备插入DNA将插入片段插入到pET载体上转化表达宿主菌诱导/优化表达目蛋白放大实验纯化目蛋白第19页蛋白抗体制备第20页多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生抗体，实际上为针对该抗原分子表面不一样抗原决定簇抗体混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体：由单一B细胞克隆产生高度均一、仅针对某一特定抗原表位抗体，称为单克隆抗体。通常采取杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术基础上，将含有分泌特异性抗体能力致敏B细胞和含有没有限繁殖能力骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特征单个杂

12、交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一个抗原表位特异性抗体即单克隆抗体。第21页据文件及DNAstar软件分析，确定各蛋白最可能抗原区序列，Primer Premier5.0软件设计引物，从基因组，扩增目标基因。克隆至pET28a载体上。转化至DH5a中，经PCR验证重组子。重组子质粒再转化至BL21(DE3)菌株中，进行小量诱导表示，确认最适条件后，进行大量诱导表示，提取大肠杆菌包涵体，溶菌酶处理，添加去垢剂，超声破碎后，溶于8M Urea中，经镍柱层析咪唑洗脱，过夜透析，无菌过滤后，免疫家兔，经过化学发光Western印迹确定多克隆抗血清效价。第22页抗原基因构筑 ：经过设计抗原序列aa个数，

13、加上载体上含组氨酸标签序列42aa，计算是否到达抗体注射免疫家兔要求（17-25kDa之间）第23页诱导表示靶蛋白 ：PCR验证基因产物是否插入载体。转化至DH5a中测序，再转化至BL21中小量诱导表示各蛋白。探索蛋白表示最适当条件，如温度、诱导时间、IPTG浓度。 0h 2h 4h 6h第24页大量诱导表示，分离包涵体 ：过夜培养25ml菌液，在5：1 锥形瓶:培养基中按1：50百分比加入过夜菌液，30-35 ，0.4mM IPTG ，按上述优化条件大量诱导表示靶蛋白。5000g,15min,弃上清，加入Binding buffer (-Urea,20mM PBS(pH 7.8),500mM

14、 NaCl)悬浮菌液。加入lysozyme（溶菌酶）至终浓度1mg/ml，室温放置30min。加入1% Triton-X-100，冰中放置10min。超声破碎120W，4s，间隔4s,5min。 上清另存用于检测。用Binding buffer (-Urea)悬浮洗涤可溶性杂蛋白。上清另存用于检测。沉淀用Binding buffer (+8M Urea)悬浮。取少许上清检测。其于冻存用于纯化。 control第25页靶蛋白纯化 :0.45um 滤器(whatman)去除细菌蛋白碎片，以利于进行组氨酸标签表示蛋白镍柱层析纯化。对蛋白进行定量（牛血清白蛋白法）。 第26页镍柱层析 :层析柱（(Po

15、ly-Prep Chromatography Column, BIORAD)中加入1.5ml 50% Ni-NTA His Bind Resin，自然沉降，无菌水冲洗，3ml binding buffer(+8M Urea )平衡。（流速10ml/h）6ml （最少3ml）binding buffer(+8m Urea)洗柱，4ml washing buffer(20mM PBS, pH 6.0, 500mM NaCl,8M Urea)洗柱 。6ml 10mM (binding buffer +),50mM,100mM, 150mM,200mM buffer依次洗柱，洗脱靶蛋白。5ml无菌水冲

16、洗。3 ml Binding buffer (+8M Urea )平衡。保留2ml Binding buffer (+8M Urea)于柱中，保留于4。 层析后蛋白样品需经过透析使Urea浓度8M降至2M，和中性条件(pH 7.2, PBS)原理：His标签是蛋白质重组技术中经惯用到一个标签，其序列为六个组氨酸HHHHHH， 其特点是分子量小，基本不改变蛋白质生物结构，不改变蛋白质溶解性，更主要是它使蛋白质纯化变得极为方便，依据组氨酸上咪唑环能够与二价金属离子结合原理，人们能够利金属离子亲和层析技术纯化带有His标签蛋白，即将含有目标蛋白裂解液经过固定二价金属离子（通常是二价Ni离子）填料，带有6*his标签蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最终再用高浓度咪唑即可将目标蛋白洗脱下来。第27页透析 ：处理好透析袋，装入约10ml层析后蛋白样品(10-15mg)。置于5M Urea PBS(pH 7.2)中，磁力搅拌机上3h，更换至2M,2M Urea PBS (pH 7.2)，各透析3h，透析后分装蛋白样品，0.22um滤器(w