RNA干扰技术专题知识讲座

1、RNA干扰技术第1页序言 真核细胞中存在着许多非编码RNA（non-coding RNA , ncRNA).这是一类不编码蛋白质但含有主要生物学功效RNA分子。 长链非编码RNA：复杂生物学功效非编码RNA 核内小RNA(snRNA) 核仁小RNA(snoRNA) 短链非编码RNA 胞质小RNA(scRNA) 催化性小RNA(核酶） 小干扰RNA（siRNA) 微RNA(miRNAs)第2页目录CONTENTS一、相关试验二、RNA干扰技术作用机制三、RNA干扰技术特点四、RNA干扰技术应用第3页相关试验PART 01第4页RNA干扰发觉秀丽隐杆线虫 1995年，康奈尔大学Su Guo博士在试

2、图阻断秀丽新小杆线虫par-1基因时，发觉了反义RNA和正义RNA都能切断par-1基因表示路径。这与传统上对反义RNA技术解释恰好相反。携带了遗传信息，能够直接翻译成蛋白质RNA。Eg: mRNA正义RNA反义RNA与正义RNA互补配正确RNA分子,不能直接用来翻译成蛋白质RNA。第5页RNA干扰发觉 1998年，华盛顿卡耐基研究院Fire等首次在秀丽新小杆线虫中证实上述现象属于转录后水平基因缄默。他们发觉Su Guo博士碰到正义与反义RNA均可阻断基因表示现象，都是因为体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引发。 纯化单链RNA：基因抑制效应十分微弱 体外转录所得RNA 纯化双链RNA

3、：高效特异性阻断对应基因表示 RNA干扰 (RNAi)第6页dsRNA及其产生方法RNA病毒入侵外源基因导入转座子转录基因组中反向重复序列（inverted repeats)转录双链RNA（Double-stranded RNA, dsRNA),双链核糖核酸。第7页RNA干扰技术作用机制PART 02第8页RNA干扰技术（RNAi)1.起始阶段2.效应阶段3.级联放大阶段 RNA干扰(RNA interference , RNAi ) 是经过小干 扰 RNA(small interference RNA , siRNA)造成目标 mRNA特异性降解, 从而使基因转录后缄默一个现象.RNAi作用

4、机制第9页1）起始阶段 dsRNA分子在细胞内被一双链 RNA酶型内切酶也叫Dicer酶剪成 21 23nt大小小干扰RNA(siRNA)。第10页1）起始阶段研究认为在3 端带有2个碱基突出黏性末端, 5 为磷酸基团siRNA诱导RNAi效应最强。第11页2）效应阶段生成siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、RED-1、DNA-RNA螺旋酶等结合形成RNA诱导缄默复合体RISC。(RNA-inducing silence complex, RISC)RNA诱导 缄默复合物形成第12页2）效应阶段siRNA引导RISC识别靶mRNA,其中反义链与靶mRNA互补结合,正义链则被置换出来。继

5、而,RISC复合物中核酸酶在靶mRNA与siRNA结合所形成双链区5起始端下游7 10nt处切断mRNA。效应阶段第13页3）级联放大阶段第14页3）级联放大阶段 此阶段以siRNA中一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RDRP)作用下,扩增产生足够数量新二级dsRNA作为底物提供给Dicer酶,产生更多siRNA,从而使效应阶段重复发生,一个完整mRNA被降解成多个2123nt小片段,从而造成对应基因表示缄默。第15页RNAi作用机制总结合效应扩剪dsRNAsiRNARNA诱导缄默复合体RISC反义链互补结

6、合核酸酶切断mRNARDRP扩增dsRNA效应阶段重复第16页RNA干扰技术特点PART 03第17页RNAi特点 RNAi是转录后水平基因缄默机制,有高度序列特异性,19ntdsRNA几乎能够完全抑制基因表示,而其中1nt突变后,它对基因抑制作用就消失了,这种高度序列特异性能够使dsRNA非常特异地诱导与之序列同源mRNA降解,防止降解与目标mRNA同家族其它mRNA从而实现对目标基因准确缄默。高特异性第18页RNAi特点 RNA存在级联放大效应,效应阶段能够循环发生,使相对极少许dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA数量)就能产生强烈RNAi效应(每个细胞仅需几分子siRNA就可产生RN

7、Ai效应),并可到达缺失突变体表型程度。相比普通siRNA,含有短发卡结构双链RNA产生RNAi效应更强。高效性第19页RNAi特点01高稳定性04050302浓度时间依赖性可传输性可遗传性靶基因位点高选择性第20页RNA干扰技术应用PART 04第21页RNAi应用在基因功效研究中应用 针对某已知基因,设计可诱导其缄默dsRNA,经过适当伎俩导入细胞或机体,使该基因表示水平下降或完全缄默,从而了解该基因功效。第22页RNAi应用在疾病治疗研究中应用 利用RNA干扰技术能够特异地缄默与疾病相关内源或外源基因,或者缄默致病过程中与一些中间代谢产物合成、分解相关蛋白基因,而不会对个体生长发育产生影响, 这一特征为 RNA 干扰在疾病治疗上应用开创了辽阔前景。第23页RNAi应用在植物抗病毒研究中应用 利用RNA干扰赋予植物病毒抗性，人为将与病毒同源dsRNA导入植物体,基于植物体RNA干扰机制对病毒基因组进行特异性切割降解, 阻止病毒复制扩散,从而保护植物体不受病毒危害。第24页文件查阅网址file:/C:/Users/xindi/Desktop/RNA干扰技术/RNA干扰技术原理与应用_孙平.pdf/view/63ed4d55cc17552707220867.