产前分子诊断中需要注意的若干问题

1、产前分子诊疗中需要注意若干问题武汉大学中南医院产前诊疗中心武汉大学中南医院临床基因诊疗中心/检验科郑 芳第1页产前诊断基本概念染色体核型分析NIPT/CNV巨细胞病毒的检测目 录第2页产前诊疗，又称宫内诊疗或出生前诊疗，是对胚胎或胎儿是否患某种严重遗传病或先天性畸形做出准确诊疗，以预防患儿出生，是预防优生学主要组成部分。一、产前诊疗基本概念（一）产前诊疗定义第3页（一）产前诊疗意义1.优生主要办法，降低出生缺点，提升全民素质2.减轻家庭及社会经济负担3.阻断致病基因在家族中传递4.给孕妇有更大空间和更多选择，对于高危孕妇一样能够怀孕而且得到一个健康小孩5.考虑要保留患病胎儿孕妇，提供宫内治疗可

2、行性，提供良好产前治疗依据一、产前诊疗基本概念第4页筛查/ 诊疗筛查/诊疗新生儿筛查筛查/诊疗三级预防一级预防二级预防产前孕前植入前一、产前诊疗基本概念出生缺点三级预防第5页（三）产前诊疗指征 35岁以上高龄孕妇羊水过多孕妇有原因不明习惯性流产史孕妇含有遗传病家族史，或系近亲婚配孕妇 X连锁遗传病基因携带者孕妇夫妇之一有致畸原因接触史孕妇 夫妇之一有染色体畸变，尤其是平衡易位携带者；夫妇核型虽正常，但生育过染色体病患儿孕妇。夫妇之一有开放性神经管畸形，或是生育过这种畸形儿孕妇夫妇之一有先天性代谢缺点，或生育过这种患儿孕妇一、产前诊疗基本概念第6页（四）产前诊疗技术产前诊疗技术包含两方面： 取材

3、技术 、试验室检测技术一、产前诊疗基本概念取材技术非侵入性：超声波检验母血胎儿细胞检验 母血胎DNA/RNA检验侵入性：绒毛取样（ 孕 7-9周） 羊膜腔穿刺（孕 16-20周）脐带穿刺（孕 20-24周） 胎儿镜检验（孕 18-20周） 第7页产前诊疗检测技术应用范围一、产前诊疗基本概念第8页（一）应选择适当时期和方法进行染色体相关疾病产前诊疗二、染色体核型分析孕期12-26+6w16w16-22w24-28w样本外周血胎儿DNA绒毛羊水脐带血方法NIPT核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS核型或核型+FISH或核型+NGS汇报时间10个工作日FISH：1w核

4、型：3wNGS：10个工作日FISH：1w核型：3wNGS：10个工作日FISH：1w核型：3wNGS：10个工作日第9页染色体核型：46，X，del （X）（q25） （二）经典案例分析A：女，36，体格检验未见显著异常二、染色体核型分析第10页染色体核型：45，XY，rob（13；13），-13，-13（二）经典案例分析B：男，50，身体健康二、染色体核型分析第11页（二）经典案例分析C： 刘，女，表型正常二、染色体核型分析 45，XX，rob（14；21）（q10；q10） 第12页 ？女方：28岁，孕3产0，胎停育2次，染色体核型：46XX, t（3;5）(q25；p15)男方：核型正

5、常孕20周，外院影像学排畸没有发觉异常二、染色体核型分析（三）各种方法平行使用A3号和5号染色体平衡异位患者胎儿CNV检测第13页愉快木偶综合征（高兴天使综合征）染色体异常：15q11-q13缺失发病率：1/40000临床特征：小头畸形、严重智力障碍、语言障碍、共济失调步态、好动、无意识发笑机制：母源性15q11-q13缺失或UBE3A基因突变二、染色体核型分析（三）各种方法交叉使用BAngelman综合征第14页患儿染色体核型未见异常二、染色体核型分析第15页FISH检测结果示：15q11-q13缺失二、染色体核型分析第16页33岁孕妇，孕24周，46，XN，B超提醒胎儿多处软指标异常，表现

6、为胎儿颈后软组织增厚，肠管回声增强，单脐动脉，对培养后羊水细胞进行了高通量测序染色体异常检测，结果显示：存在1处染色体结构异常：22q11.21-22q11.23存在2.3M缺失，该片段包UBE2L3,YDJC,CCDC116等几十个基因或基因片段。22q11.21-22q11.23区域片段缺失与22q11.2缺失综合征（22q11.2 deletion syndrome）相关，临床表现为身材矮小，面部异常，智力障碍等。二、染色体核型分析（三）各种方法交叉使用核型正常，B超异常染色体原因深度排查第17页（一）NIPT结果分析？ 结果检测项目阳性真阳性假阳性假阴性拒绝随访/失联21三体0.199

7、%0.111%0.044%0.022%0.044%性染色体异常0.155%0.044%0.044%-0.066%二、NIPT/CNV第18页NIPT假阳性胎儿染色体核型分型重视知情同意2.NIPT假阴性重视影像学检验？ 结果检测项目阳性真阳性假阳性假阴性拒绝随访或失联21三体0.199%0.111%0.044%0.022%0.044%（个别拒绝随访）性染色体异常0.155%0.044%0.044%-0.066%二、NIPT/CNV第19页胎盘嵌合-假阳性发生率约1/1000New England Journal of Medicine，371;6 577-578（）第20页胎盘嵌合-假阴性21

8、17周NIPT检测结果：45，XO；羊穿结果：47，XX，+18Molecular Cytogenetics. , 7:48第21页假阴性原因排查过程原因排查过程取样：母亲血细胞DNA、胎儿组织、胎盘组织分析方法：测序、FISH和CMA母亲核型正常 46，XX （排除母体干扰）NIPT流产胎儿组织： T18 胎盘组织：45, X (60%) and T18 (嵌合率30%) FISH流产胎儿组织： T18 胎盘组织：45, X cells (67%, 62/92) and T18 cells (30%, 28/92) SNP-array流产胎儿组织： T18 胎盘组织：45, X cells

9、(67%) and T18 cells (50%) 胎儿为100%浓度47，XX，+18胎盘嵌合，大部分细胞为45,XO; 少许细胞为47，XX，+18 第22页母体本身染色体异常干扰样本ID试验编号chr13chr18chr21180100721-0.426 3.713 -1.256 180100722-0.576 3.229 0.366 180100723-1.109 4.207 -0.676 180100724-1.015 2.816 -0.631 孕妇年纪30岁，孕27周，NIPT屡次上机均提醒T18高风险。胎儿B超未发觉任何异常，羊穿显示为46，XY。以后CNV分析显示为母体18号染

10、色体短臂微重复所致假阳性。第23页影响无创产前筛查原因母体染色体核型异常：母体实质肿瘤：发生内在基因组成改变情况胎盘嵌合体（confined placental mosaicism，CPM）染色体单亲二倍体（uni-parentaldisomy, UPD）胎儿嵌合孪生儿消失现象胎儿游离DNA浓度太低：试验室操作错误 第24页孕周 （12W）妊娠情况（单胎/双胎/多胎?）既往病史 如异体输血、移植手术、干细胞治疗、免疫治疗、肿瘤、病毒感染等可能引入外源DNA或改变胎儿游离DNA组成和百分比，影响检测结果）样本状态及运输溶血？是否及时采取冷链运输知情同意非常主要！分析前质量控制第25页分析中质量控

11、制产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区合理试验室分区严格试验室环境控制（如温湿度，稳压或不间断电源）仪器设备及管理（PCR仪、离心机、加样器等定时维护并校准）人员资质及培训第26页产前筛查与产前诊疗（全基因组低拷贝测序技术）缓冲间测序区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向文库扩增与检测区标本与文库制备区试剂准备区第27页胎儿游离DNA浓度测定方法 多重SNP法 (4%)Y染色体法文库构建-DNA片段筛选尽可能消除母体基因组DNA背景干扰，富集游离DNA（cfDNA）分析中质控第28页准确文库质检是后

12、续取得高质量、均一数据关键分析中质量控制荧光定量标准曲线法文库浓度测定：1.qPCR法/Qubit对DNA浓度准确定量；2.Aiglent 2100对文库质量进行定性2100检测结果第29页分析后质量控制 审核项数据要求异常处理原始数据量（M）3.5M重上机Q30(1000个碱基中错误率)85重上机Unique reads数量（M）2M重上机比对率62.5%重建库Duplication率15%重建库样本GC含量EDTA: 38%-42%Ardent: 35%-42%重建库分析完成后，首先查看原始数据量，Q30，对照品结果和GC偏移度是否经过等等.下机样本数据要求第30页（二）CNV结果解读发觉

13、明确致病基因组拷贝数变异（CNVs）未检出染色体非整倍体或100kb以上已知明确致病基因组拷贝数变异（CNVs）其它类型100Kb以上拷贝数变异（CNVs）数据库中没有统计数据库中统计为多态性二、NIPT/CNV第31页CNV结果分析样本类型临床意义没有检出致病性CNV意义不明CNV多态性总例数外周血43110761羊水0241126流产物34115353脐血10001总数7836161114二、NIPT/CNV第32页尤其关注！第33页巨细胞病毒感染现况胎儿先天性巨细胞病毒感染后果巨细胞病毒血清学检测巨细胞病毒分子检测重视孕妇和新生儿巨细胞病毒检测四、巨细胞病毒检测第34页1.巨细胞病毒感染

14、现况巨细胞病毒血清学检测IgG和IgM滴度IgG亲和力四、巨细胞病毒检测第35页1.巨细胞病毒感染现况IgG抗体检测阳性率：90%IgM抗体检测阳性率（4.5个月） 产科+生殖科：11/1038=0.0106儿科：41/940=0.0436四、巨细胞病毒检测围产期感染宫内感染(先天性CMV感染)第36页2. 胎儿巨细胞病毒感染我国育龄妇女几乎均为巨细胞病毒抗体阳性；巨细胞病毒先天性感染是儿童感觉神经性耳聋最主要病因，早期诊疗价值高；抗体阳性孕妇对巨细胞病毒垂直传输并不低于孕期胎儿原发性感染。四、巨细胞病毒检测第37页垂直传输：病毒血症孕妇垂直传输率高达44%不良妊娠结局：死胎90%出生时没有症

15、状，后遗症13%10%出生时有症状，60%后遗症：听力、视力、智力，脑发育和肝脾、血液系统等（7岁前发生）羊水病毒载量与垂直传输风险和后遗症症状相关原发性感染复发性感染潜伏在体内CMV被重新激活再次感染外源性其它血清型病原体。第38页假如妊娠前免疫状态未知，诊疗基于特异性IgM抗体，特异性IgM抗体阳性孕妇只有部分为原发性感染复发性感染孕妇中也可检出IgM抗体，而且原发性感染数月后血清中还可检出IgM抗体IgM抗体阳性可能还包含IgM抗体假阳性者抗体：间隔34周后重复测定诊疗依据包含血清转化现象(首次血清抗体阴性孕妇出现特异性IgG抗体)，或者IgG抗体滴度增加4倍IgG抗体亲和力测定：亲和力指数30，提醒孕妇CMV感染为近2-4个月内原发性感染。IgM抗体阳性伴随低亲和力IgG抗体在诊疗母体原发性CMV感染方面优于单纯血清抗体检测。病毒分离培养或PCR检测感染血液、尿液、唾液、宫颈分泌物或母乳乳汁诊疗。3. 识别妊娠期母体原发性CMV感染困难四、巨细胞病毒检测第39页4. 重视巨细胞病毒分子检测孕期巨细胞病毒分子检测，明确孕妇荷毒量；必要时候进行羊水巨细胞病毒载量检测；胎儿CMV感染诊疗方法为羊水病毒培养或采取PCR方法测定病毒DNAPCR检测，孕21周检验阳性率高对孕妇巨细胞病毒抗体阳性，载毒量高孕妇，需要检测新生儿血或者