单克隆抗体制备流程

1、单克隆抗体制备流程Preparation of monoclonal antibodies第1页单克隆抗体介绍单克隆抗体生产单克隆抗体应用01020304制备流程目录第2页01单克隆抗体介绍第3页1.1 抗原（antigen）定义： 能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与抗体和致敏淋巴细胞结合，发生免疫效应(特异性反应)物质。类型（起源）：异种抗原：病原微生物、类毒素等不一样种族之间抗原；同种异型抗原：存在于同一个族不一样个体之间抗原，如 ABO 血型抗原、Rh抗原,、MHC等；本身抗原：本身成份，分为隐蔽本身抗原、改变本身抗原等，如眼晶状体蛋白等；异嗜性抗原：又称 Forssman 抗原

2、，存在于不一样物种间表面无种属特异性共同抗原，可存在于动物、植物、微生物及人类中，如溶血性链球菌于人心内膜或肾小球基底膜所含有共同抗原就是异嗜性抗原。 在单克隆抗体制备中： 通常选取每只小鼠/大鼠每次注射 1050ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特 异性单克隆抗体。第4页1.2 抗体（antibody）定义： 由效应B细胞分泌，用来判别与中和抗原大型 Y 形蛋白质，仅在脊椎动物血液等体液中及其 B 细胞细胞膜表面发觉。类型（按理化性质和生物学功效）：IgM：免疫应答中首先分泌抗体。与抗原结合后开启补体级联反应。它们还把入侵者相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞吞噬；IgG：激活

3、补体（辅助和补充特异性抗体），中和各种毒素。IgG连续时间长，是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿抗体。他们还从乳腺分泌进入初乳，使新生儿得到保护；IgA：进入身体黏膜表面，包含呼吸、消化、生殖等管道黏膜，中和感染因子。还能够经过母乳初乳把这种抗体输送到新生儿消化道黏膜中，是在母乳中含量最多，最为主要一类抗体；IgE：抗体尾部与嗜碱细胞、肥大细胞细胞膜结合。当抗体与抗原结合后，嗜碱细胞与肥大细胞释放组织胺一类物质促进炎症发展。这也是引发速发型过敏反应抗体；IgD：作用还不清楚。主要出现在成熟 B 淋巴细胞表面上，可能与 B 细胞分化相关。 在单克隆抗体制备中：通常是产生 IgG 型抗体第5页1

4、.3 特异性免疫-体液免疫第6页1.4 单克隆抗体定义： 由单一 B 细胞克隆产生高度均一、仅针对某一特定抗原表位抗体。类型（起源）：鼠源性单克隆抗体：将免疫接种过小鼠 B 细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出既能无限增殖又能分泌抗体杂交瘤细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。嵌合性单克隆抗体：用人恒定区取代小鼠恒定区，保留鼠单抗可变区序列，形成一个人-鼠杂合抗体。可大幅降低异源抗体免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部特异性和亲和力。人源化单克隆抗体：利用现有已详细分析过小鼠抗体，取其与抗原直接接触抗体片段（互补决定区，CDR）与人抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持特异性和大部分亲和力，同时几乎去除免

5、疫原性和毒副作用。全人源单克隆抗体：抗体可变区和恒定区都是人源，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备相关技术有：人杂交瘤技术、EBV 转化 B 淋巴细胞技术、噬菌体显示技术（phage display）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenic mouse）和单个B细胞抗体制备技术等。第7页1.5 杂交瘤技术杂交瘤(hybridoma)抗体技术： 在细胞融合技术基础上，将含有分泌特异性抗体能力致敏B细胞和含有没有限繁殖能力骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特征单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一个抗原表位特异性抗体即单克隆抗体。第8页02制备流程第9页 试验原理第10页2.1

6、抗原准备2.1.1 分子克隆与蛋白纯化提取目基因：在数据库中查找目基因序列，设计引物，PCR扩增目基因构建载体：将扩增目标基因构建到质粒上，转入宿主中诱导表示：经过化学试剂诱导宿主大量表示蛋白蛋白纯化：用特定方式将目标蛋白提取出来并纯化第11页2.2 动物免疫2.2.1 动物免疫与效价测定抗原乳化：将抗原与佐剂混合，在乳化器上进行乳化腹腔注射：将乳化好抗原经过腹腔注射进入小鼠体内，两周后再注射一次测定效价：尾部取血后分离血清，经过ELISA法测定小鼠血清效价加强免疫：融合前三天进行加强免疫，不加佐剂，只注射抗原第12页2.3 细胞融合2.3.1 细胞融合与培养骨髓瘤细胞培养：提前复苏并扩大培养

7、SP2/0细胞取脾脏：处死小鼠，取其脾脏并研磨制成细胞悬液细胞融合：将骨髓瘤细胞与脾细胞按百分比混合后，加入PEG促进融合选择培养基培养：融合好细胞移至96孔板中培养，一段时间后，未融合成功细胞死亡第13页2.3 细胞融合2.3.2 细胞筛选效价测定：取细胞上清液，ELISA法测定抗体效价细胞扩培：将效价高孔转移至24孔板内扩大培养克隆化培养：将融合细胞制成悬液移入96孔板中，尽可能确保每孔只含一个细胞复筛：ELISA+免疫组化双重筛选，挑选效价高、定位清楚克隆扩培第14页2.4 亚型判定2.4.1 亚型判定 采取ELISA 法分别对单克隆抗体轻链和重链亚型进行判定。 轻链：分为(kappa)和(lambda) 重链： IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA/x/page/b0506iyb6b9.html/v/XMjI4NzE5NjE0OA=.html/v_show/id_XMTU3OTUzOTI0.html第15页03单克隆抗体生产第16页3.1 生产方式：体内/体外第17页3.2 抗体纯化亲和层析法纯化抗体：第18页04单克隆抗体应用第19页4.1 单克隆抗体应用检验医学诊疗试剂病原微生物肿瘤检测细胞因子检测免疫抑制剂治疗本身免疫疾病和抗器官移