蛋白质工程课件

1、蛋白质工程具备的知识基础：分子生物学、分子遗传学、 生物化学、微生物学、 细胞学及化工、计算技术等蛋白质工程课程的主要任务：1掌握蛋白质工程科学的基本原理、基础知 识2熟悉蛋白质科学与工程研究的主要方法和技术3了解蛋白质工程领域的研究方向与最新科技成果蛋白质工程第一节 绪论内容 （1）蛋白质化学（2）蛋白质工程2基本要求 知道蛋白质的概念， 了解蛋白质的生物学功能； 掌握蛋白质工程的概念；蛋白质工程与基因工程的联系和区别绪论A 蛋白质化学B 蛋白质工程概念C 蛋白质工程操作流程D 蛋白质工程研究方向E 蛋白质数据库 F 蛋白质工程研究成果及存在问题G 基因工程概念H 蛋白质工程与基因工程的联系

2、与区别Protein: G. J. Mulder 在1838年首次提出。蛋白质是细胞原生质的主要组成成分，其与核酸一起共同构成了生命的物质基础概念：蛋白质是由20种a-氨基酸组成的高分子有机物质,在体内执行多种生理功能蛋白质化学一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学 6 .25 16的倒数，每测定g 氮相当于6 .25g的蛋白质。也就是1 g 氮所代表的蛋白质量（克数）蛋白质含量蛋白氮6 .25蛋白质的分类(Classification of proteins)(一).依分子形状分类(Classified ac

3、cording to shape)球状蛋白质：血红蛋白、血清球蛋白等纤维状蛋白质：胶蛋白、丝蛋白等(二).依蛋白质组成（Classified according to composition）简单蛋白质：水解为-氨基酸结合蛋白质：单纯蛋白质+辅基 如色蛋白、糖蛋白、磷蛋白等(三).依蛋白质溶解度（Classified according to solubility）清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白(四).依蛋白质功能（Classified according to function）活性蛋白质非活性蛋白质蛋白质的大小与分子量蛋白质分子量的变化范围很大，从大约600010

4、00000道尔顿（Da）或更大某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万道尔顿分子量6000时，有完整的生物学功能分子量6000时，不完全有生物学功能。一、蛋白质的元素组成二、蛋白质的分类三、蛋白质的大小与分子量四、蛋白质的功能五、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质化学 蛋白质的生物功能Proteins have many different biological functions1).酶的催化功能(Enzymatic catalysis)Fireflies emit light catalyzed by

5、luciferase(荧光素酶)with ATP2).运输和储存功能 Transport and storageErythrocytes（红细胞） contain a large amount of hemoglobins（血红蛋白）, the oxygen-transporting protein.3).机械功能(Mechanical functions)The protein keratin （角蛋白） is the chief structural components of hair, scales, horn, wool, nails and feathers.5).保护功能(Pro

6、tection) 6).信息传递功能(Information processing)Simple Anatomy of the Retina1）发现了数千种不同功能和来源的蛋白质2）其中有上千种蛋白质的氨基酸排列顺序已被测定出来3）上百种已获得高分辨的分子结构解析图这些成就,特别是蛋白质结构与功能的特殊联系方面的成就, 为改造蛋白质奠定了关键的基础蛋白质化学的研究成果绪论A 蛋白质化学B 蛋白质工程概念C 蛋白质工程操作流程D 蛋白质工程研究方向E 蛋白质数据库 F 蛋白质工程研究成果及存在问题G 基因工程概念H 蛋白质工程与基因工程的联系与区别主要内容：1）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空

7、间结构的蛋白质2）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系 基本目的：1）实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能2）设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质 蛋白质工程定义： 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质蛋白质工程绪论A 蛋白质化学B 蛋白质工程概念C 蛋白质工程操作流程D 蛋白质工程研究方向E 蛋白质数据库 F 蛋白质工程研究成果及存在问题G 基因工程概念H 蛋白质工程与基因工程的联系与区别1、分离纯化0.1-1.0mg

8、纯蛋白质2、测定其部分肽段一段结构，根据编码原则合成相应同位素标记的寡苷酸探针3、以此从基因库中分离编码该蛋白质的克隆化基因，转入噬菌体M13系统，用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析4、通过表达载体获得较大量(0.1-1.0克)该蛋白质用于空间结构测定及结构与功能研究，借助计算机提出分子预测性质及改造方案5、通过寡核苷酸M13系统定点诱变并分离其突变体，引入表达载体生产并纯化突变性蛋白质，分析其性质指导进一步分子设计，以最终获得所预期性质的分子 绪论A 蛋白质化学B 蛋白质工程概念C 蛋白质工程操作流程D 蛋白质工程研究方向E 蛋白质数据库 F 蛋白质工程研究成果及存在问题G 基因工程概念H

9、 蛋白质工程与基因工程的联系与区别1）蛋白质结构分析 2）蛋白质结构预测 3）改造或创造新蛋白质 主要研究方向1、蛋白质结构分析（研究核心） 1）收集大量的蛋白质分子结构的信息 2）建立结构与功能之间关系的数据 3）蛋白质结构与功能之间关系的理论研究 三维空间结构的测定是证明新结构改变了原有生物功能的必需手段 蛋白质工程主要事件：1934年，胃蛋白酶的x射线衍射照片 J.Bernal, D.Crowfoot1957年，肌红蛋白晶体结构 Kendrew1956年，维生素B12晶体结构 D.C.Hodhkin1959年，血红蛋白晶体结构 Perutz蛋白质结构分析主要技术：晶体学技术（x射线晶体结

10、构分析）：1.对原材料的要求：具有高度的均一性；影响因素有金属离子、辅酶或一些成键的辅助集团的变化或缺失；蛋白质的酶解、氧化和还原；蛋白质的聚合效应等2.晶体生长的生化条件：pH值、离子强度、沉淀剂和添加剂的浓度等因素缺陷：需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克-几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析蛋白质结构分析主要技术：多维核磁共振波谱技术：二维同核核磁共振方法：对氢原子核的二维核磁共振信号进行分析，主要用于类蛋白质多维异核核磁共振方法：1H、13C、15N，主要用于分子量高于10kDa的蛋白质和螺旋的多肽优点：样品要求低（蛋白质可溶性、高稳定性、高丰度）； 分析液态下

11、的肽链结构 。已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理 。可以更有效地分析蛋白质的突变 缺点：仅限于分子量较小的蛋白质蛋白质结构分析研究现状蛋白质空间结构的测定已经成为生命科学的“瓶颈”美国NIH投资1.25亿美元，计划测定1万个蛋白质晶体结构；日本RIKEN将建16台高分辨率核磁共振仪，用来测定小分子蛋白质结构技术上的障碍：在克隆、表达、纯化和结晶过程中，大约20个蛋白质中能得到1个可供结构测定的晶体，并且一些蛋白质（膜蛋白）根本不可能被结晶现阶段主要研究手段根据氨基酸序列从理论上计算其相应空间结构成

12、为蛋白质领域内科学家们的奋斗目标蛋白质结构分析主要研究方向：1）蛋白质结构分析 2）蛋白质结构预测 3）改造或创造新蛋白质 蛋白质工程2、结构预测 1）对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能2）根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构 蛋白质工程1、理论分析方法或从头算方法(Ab initio)：该类方法假设折叠后的蛋白质取能量最低的构象 2、统计方法：对已知结构的蛋白质进行统计分析，建立序列到结构的映射模型，进而根据映射模型对未知结构的蛋白质直接从氨基酸序列预测结构。这一类方法包括经验性方法、结构规律提取方法、同源模型化方

13、法等 蛋白质结构预测主要技术： 分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能 研究现状：尚在起步阶段 蛋白质结构预测主要研究方向：1）蛋白质结构分析 2）蛋白质结构预测 3）改造或创造新蛋白质 蛋白质工程创造和改造蛋白质：1）物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等2）生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等 缺点：缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用 3）基

14、因重组技术或人工合成DNA：可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质 蛋白质工程 修饰目标明确 在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究 蛋白质工程基因工程技术在蛋白质工程中的应用 定点突变：改变其中的一个或两个三联密码就可以改变氨基酸 盒式突变 ： 1985年Wells提出的一种基因修饰技术盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析 PCR技

15、术 ：直接、快速和高效 高突变率技术 ：硫代负链法：核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（S）dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（S）dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从35扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，就可以得到二条链均为突变型的基因UMP正链法：大肠杆菌突变株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠杆菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制 蛋白质融合 ：将不同蛋白质的特性

16、集中 在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等 绪论A 蛋白质化学B 蛋白质工程概念C 蛋白质工程操作流程D 蛋白质工程研究方向E 蛋白质数据库 F 蛋白质工程研究成果及存在问题G 基因工程概念H 蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质数据库1、核酸序列数据库EMBL（European Molecular Biology Laboratory)http:/www.ebi.ac.uk/embl/GenBank/GenBank2、蛋白质序列数据库由瑞士Swiss Institute of Bioinformatics 和 European Bioinformatics

17、Institute合建 /蛋白质数据库3、蛋白质结构数据库（PDB）由美国Brookhaven National Laboratory开发4、蛋白质二级结构数据库（DSSP）Wolfgang Kabsch and Chirs Sander设计http:/www.sander.ebi.ac.uk/dsspftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/dssp蛋白质数据库绪论A 蛋白质化学B 蛋白质工程概念C 蛋白质工程操作流程D 蛋白质工程研究方向E 蛋白质数据库 F 蛋白质工程研究成果及存在问题G 基因工程概念H 蛋白质工程与基因工程的联系与区别蛋白质工程的成果1.基础研究

18、方面: 酪氨酰tRNA合成酶是应用蛋白质工程技术研究得比较深入的酶之一。该酶在ATP 存在的条件下可催化酪氨酸活化酪氨酸转移到tRNA的3末端形成酪氨酰tRNA2. 实际应用方面: 到目前为止尽管人类已经发现了数千种酶,但是真正具有商业价值即每年销售额可超过1000万美元的酶不过数十种蛋白质工程的成果 诱变蛋白质 氨基酸突变 原定目标 结果 T4溶菌酶 IluCys 构建二硫键 成功 增加热稳定性 枯草杆菌 GlyLys 拓宽酶作用的 成功 蛋白酶 底物范围 AlaLeu 提高抗氧化性能 -抗凝酶 MetVal 提高抗氧化性能 成功 胰蛋白酶 GlyAla 提高酶水解专一性 成功 -内酰胺酶

19、SerCys 验证Ser对该酶 成功 的重要性 -干扰素 CysSer 提高稳定性 成功 白细胞介素-2 CysSer 提高产物活性 不成功 二氢叶酸 AspAsn 验证酶的活性 成功 中心还原酶 蛋白质工程在医学上的应用1）提高蛋白质的稳定性 如葡萄糖异构酶 （GI）突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10-12；酶比活相同 2）融合蛋白质 化学合成的脑啡肽 EnkN端5肽编码区，通过一连接3肽编码区与人1型干扰素 IFN基因连接，在大肠杆菌中表达这一融合蛋白 ，融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN 3）蛋白质活性的改变 将胰岛素B链改为B28LysB29Pro

20、，获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床实验。 4）治癌酶的改造 5）嵌合抗体和人缘化抗体 嵌合抗体就是用人抗体的恒定区替代鼠单克隆抗体的恒定区，这样它的免疫原性就显著下降 人缘化抗体就是将抗原吸附区域嫁接到人抗体上，这样抗体上的外源肽链降低到最小，免疫原性也就最小 。人缘化抗体如治疗脊髓性白血病的ANTICD33等，其免疫反应可以忽略不计 蛋白质工程在农业方面的应用 饲料用酶的分子改良与产品研制 饲料用抗菌肽的分子改良与产品研制 重要农作物蛋白质标记的分离鉴定 食品用酶及抗氧化酶的分子改良与产品研制 有机磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良与产品研制 重大动物疫病快速检测试剂的研发 饲料用酶的

21、分子改良与产品研制 针对饲料用酶的特殊要求, 重点开展最具应用价值和市场急需的木聚糖酶、b-葡聚糖酶、a-半乳糖苷酶、b-甘露聚糖酶、角蛋白酶等饲料用酶的分子改良和产品研制, 获得同时具有高比活、耐高温、pH作用范围广、抗胃肠道蛋白酶等高性能的改良酶, 构建高效表达工程菌, 建立高效发酵生产工艺技术及相关技术标准, 实现产业化生产 饲料用抗菌肽的分子改良与产品研制 针对饲料用抗菌肽的特点和要求，应用蛋白质工程分子设计技术和高效表达技术，开展防御素、Cathelicidin等抗菌肽的分子改良和产品研制，获得对主要饲料有害真菌和细菌均有高效杀灭作用的广谱抗菌肽，构建高效表达工程菌，建立高密度发酵技

22、术和产品后加工技术，并确立饲料用抗菌肽的产品标准和应用技术规范，实现产业化生产 重要农作物蛋白质标记的分离鉴定 建立分离鉴定重要农作物的蛋白质标记的技术体系，形成一批具有自主知识产权的蛋白质标记,为我国重要农作物的分子育种与分子改良提供重要的技术支撑 食品用酶及抗氧化酶的 分子改良与产品研制 重点开展乳糖酶、超氧化物歧化酶、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶、弹性蛋白酶的产品研制。通过分子改良获得具有高比活、耐高温和耐酸碱等优良综合特性的改良酶。构建高效表达工程菌，完善酶制剂的高效发酵及后加工技术，实现产业化生产有机磷降解酶及毒素解毒酶 的分子改良与产品研制通过蛋白质分子改良和修饰技术，改造拥有自主知识

23、产权的有机磷降解酶、黄曲霉毒素解毒酶和N-酰化高丝氨酸内酯降解酶，获得同时具有催化活性高、pH作用范围宽和广谱降解能力的改良酶，构建高效表达工程菌,完善高效发酵和后加工技术,建立酶的应用技术体系，实现产业化生产 重大动物疫病快速检测试剂的研发 利用核酸体外扩增技术、基因工程技术、蛋白质工程技术以及单克隆抗体技术，设计表达和大量生产重大动物疫病病原微生物（禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、蓝耳病病毒等）的主要抗原性蛋白及这些抗原性蛋白的特异性单克隆抗体，建立上述蛋白的高密度培养、大规模纯化和质量控制技术。同时利用免疫扩散技术、胶体金标记技术及仿细胞膜模型建立体外蛋白识别体系，开发适用于野外和现场检测的新型胶体金快速检测试纸等生物传感器，为动物重大疫病及人畜共患传染病的抗原检测和抗体水平评价提供实时、高效的监测技术手段和产品 蛋白质工程存在的问题1.构象的快速测定手段: 以分子定向改造为目标的蛋白质工程须借助于精确的三维结构信息,而目前主要靠X-射线单晶体结构分析,受到单晶培养的限制。目前正在寻求通过电子衍射三维分析、二维核磁共振等手段来克服上述限制2. 基因高效表达以及有效的下游技术 寻找高效表达载体、分泌性寄生系统以及各种高效批量分离技术是克服这一限制的关键蛋白质工程存在的问题绪论A 蛋白质化学B 蛋白质工程概念C 蛋白质工程操作流程D