植物组织培养及人工育种

1、四川草原 2005年第12期生物技术在牧草及草坪草中的应用研究进展何 玮（重庆市畜牧科学研究院，重庆400039）摘要：现现代生物物技术在在牧草及及草坪植植物育种种工作中中的运用用为其打打开了一一个崭新新的局面面。组织织培养和和再生体体系的建建立为基基因片段段的转移移和转化化提供了了前提条条件。本本文对目目前遗传传转化中中几种较较为常见见的方法法作了较较为详细细的阐述述，并对对其发展展趋势提提出了一一些看法法，同时时，也提提出了转转基因植植物的生生物安全全问题。关键词：组织培培养； 遗传转转化；育育种Advaanceed iin GGeneeticc Trranssforrmattionn o

2、ff Fooraggegrrasss annd TTurffgraassHe WWei(Choongqqingg Muuniccipaal IInsttituute of Aniimall Huusbaandrry, Choongqqingg 40000339)Absttactt: AAdopptinng mmodeern gennetiic ttechhnollogyy wiill impprovve bbreeedinng oof fforaageggrasss aand turrfgrrasss. TThe tisssuee cuultuure andd a reggeneerattio

3、nn syysteen hhavee beeen devveloopedd foor ddireect DNAA trranssferr. TThe ressearrch advvancces in gennetiic ttrannsfoormaatioon oof fforaageggrasss aand turrfgrrasss inn reecennt yyearrs wweree syysteematticaallyy reevieewedd, aand inttrodduceed ddetaail thee prrimaary metthodds oof ggeneeticc trr

4、anssforrmattionn off grrasss. AAt tthe samme ttimee, bbiollogiicall saafetty iissuue wwithh trranssgennic graass shoouldd allso be evaaluaatedd.Key worrds: tiissuue ccultturee; ggeneeticc trranssforrmattionn; bbreeedinng传统的牧牧草及草草坪草育育种基于于使用自自然变异异，如介介于生态态型之间间或之内内，或通通过有性性生殖获获得天然然变异，但这些些传统育育种方法法的局限限性也日日

5、益明显显1。将现现代遗传传转化(转基因因)技术术融合到到传统的的育种手手段中，有助于于解决一一些常规规育种方方法难于于解决的的特殊问问题牧牧草生物物技术研研究始于于20世纪纪80年代代后期，因其植植株再生生频率低低，同时时应用前前景不及及农作物物而发展展滞后2。现在，人们已已经认识识到了生生物技术术在改良良牧草及及草坪草草品种上上具有的的潜力。目前可可形成再再生植株株的禾本本科牧草草和草坪坪草约有有65个种种，300多个属属，此外外对200多个种种建立了了遗传转转化体系系3。随着着现代生生物技术术的发展展，将遗遗传转化化的转基基因技术术与传统统育种手手段相结结合，不不仅能够够拓宽种种质资源源的

6、范围围，而且且能更有有效的利利用现有有的遗传传变异体体，为牧牧草及草草坪植物物改良和和新品种种选育打打开了一一个崭新新的局面面。1. 组组织培养养及植株株再生体体系的建建立众所周知知，植物物组织培培养阶段段是目前前大多数数转基因因方法所所必需的的，一个个良好的的再生体体系可以以极大地地缩短转转基因育育种年限限，提高高育种的的成功率率。由于于早期采采用了已已成熟和和分化的的组织作作外植体体，难以以脱分化化形成愈愈伤组织织，使得得牧草及及草坪草草体外培培养的研研究进度度较慢。1.1 外植体体的选择择禾本科牧牧草的组组织培养养再生相相对较难难，主要要是适用用的外植植体较单单一44，5。Dalle对一

7、一年生黑黑麦草未未成熟胚胚建立植植物再生生的方法法可谓是是禾本科科草较为为早期的的研究6。Mcddonnnel和和Conngerr，Boyyd和Dalle用草草地早熟熟禾的成成熟种胚胚作外植植体，得得到了愈愈伤组织织和再生生苗，但但分化率率很低7，88。Vann deer VValkk等曾报报道了草草地早熟熟禾成熟熟胚及幼幼穗的组组织培养养结果，认为幼幼穗是草草地早熟熟禾诱导导胚性愈愈伤组织织的最好好外植体体，并利利用幼穗穗愈伤组组织建立立了悬浮浮细胞系系，分离离培养原原生质体体并得到到了白化化苗和分分化的根根9。而对对这方面面的研究究，国内内起步较较晚，报报道也少少。朱根根发、余余毓君用用幼

8、穗、胚轴作作外植体体，研究究了早熟熟禾的组组织培养养特性，得出了了幼穗是是最佳外外植体的的结论10。余桂桂红等的的研究表表明，高高羊茅茎茎段和花花序出愈愈率和愈愈伤组织织分化率率较低，幼穗和和未成熟熟胚出愈愈率和愈愈伤组织织的分化化率较高高，但取取材受到到时空的的限制，而成熟熟种子可可以作为为诱导愈愈伤组织织的理想想材料11。外植体取取材部位位不同，其诱导导产生胚胚性愈伤伤组织以以及再生生的能力力也有所所差别，因而，未成熟熟胚也常常用于多多年生黑黑麦草12(Looliuum ppereennee L)和狗牙牙根113，114(Cynnodoon ddacttyloon VVar)胚性愈愈伤组织

9、织的诱导导；叶片片基部的的切片用用于鸭茅茅155(DDacttyliis gglommeraata L.)、高羊羊茅116(Fesstucca aarunndinnaceea SSchrreb)和多花花黑麦草草177(LLmuhhiflloruum LLam)胚性愈愈伤组织织的诱导导。以上结果果表明，愈伤组组织的诱诱导率和和外植体体的选择择密切相相关。但但这些外外植体（幼胚、幼穗、花药、原生质质体、悬悬浮细胞胞等）或或取材困困难，或或受季节节限制不不能周年年供应。近年来来研究者者们探索索了以盾盾片、胚胚轴等为为外植体体诱导再再生植株株的途径径100，但但植株再再生频率率低，还还需进一一步优化化

10、完善离离体培养养条件。1.2 培养基基的化学学组成对对组织培培养及植植株再生生的影响响1.2.1 植植物激素素培养基的的化学组组成对禾禾本科草草愈伤组组织的形形成，细细胞培养养和植物物再生至至关重要要。一般般高盐的的MS培养养基常用用于草坪坪草愈伤伤组织的的培养，高浓度度的2，4-D或Diccambba和低低浓度的的细胞分分裂素(如6一BA，激激动素)共同存存在，促促进愈伤伤组织的的启动11。朱根根发等的的研究表表明，草草地早熟熟禾幼穗穗培养的的适宜22，4-DD浓度在在1 mggL-1以下下，培养养基中添添加1.5 mggL-1生物物素或将将KH2PO4浓度提提高到4400 mgL-11，可

11、能能对胚性性愈伤组组织的诱诱导及筛筛选有一一定的作作用110。王铖等等的试验验结果发发现2，4-DD是影响响高羊茅茅种子愈愈伤组织织诱导的的关键因因素，而而高羊茅茅种子愈愈伤组织织的诱导导只有在在适宜的的激素和和环境条条件的共共同作用用下，才才能具有有较高的的诱导率率和较好好的形态态结构18。刘文文真等对对多年生生黑麦草草组培的的研究结结果表明明，在愈愈伤诱导导培养基基中加入入diccambba比加加入2，4-DD的效果果要好，这一结结果和GGrifffinn等及玄玄松南等等对草地地早熟禾禾的研究究报道相相一致19。Broosemma等报报道多年年生黑麦麦草在高高浓度22，4-DD的作用用下形

12、成成很少的的胚性愈愈伤，甚甚至不形形成愈伤伤200。1.2.2 蛋蛋白水解解物许多学者者在研究究中发现现，在培培养基中中加入蛋蛋白水解解物有利利于促进进胚性愈愈伤组织织的启动动。Shhettty等在在对一些些重要的的禾本科科植物的的研究中中发现，脯氨酸酸和谷氨氨酰胺有有利于组组织培养养中胚性性愈伤组组织的发发生221。而吴关关庭等的的试验表表明，酪酪蛋白水水解物、脯氨酸酸和肌醇醇等有机机物可促促进未成成熟胚的的愈伤组组织诱导导，但对对成熟种种子愈伤伤组织诱诱导及这这两种外外植体来来源的愈愈伤组织织的再生生没有作作用或产产生不利利影响22。但Arrtunnduaaga等等认为水水解酪蛋蛋白可以以

13、改善愈愈伤组织织的质量量和提高高再生率率233。刘刘文真等等对黑麦麦草的组组培试验验表明高高质量浓浓度的氨氨基酸添添加物与与对照相相比并没没有改善善植株的的再生率率199。因因此，正正确合理理的使用用这些氨氨基酸添添加物还还需进一一步研究究。1.2.3 碳碳水化合合物除了在培培养基中中加入适适量的植植物激素素和蛋白白化合物物对胚性性愈伤组组织的形形成和植植株再生生有一定定的影响响以外，加入适适当的碳碳水化合合物，也也会影响响胚性愈愈伤组织织的发生生和植株株再生。在谷类类植物的的组织培培养中显显示，以以麦芽糖糖为C源效果果要好于于蔗糖24。但ZZaghhmouut发现现在紫羊羊茅愈伤伤组织长长期

14、培养养和悬浮浮培养中中，随着着蔗糖浓浓度的增增加（至至6.22%），植株再再生能力力增强，白化苗苗数量下下降，同同时在不不含激素素的1/2MSS和B55继代培培养基中中，加入入高浓度度的蔗糖糖有利于于获得再再生植株株255。119922年，DDaltton等等也表明明在培养养基中加加入凝胶胶和碳水水化合物物，能明明显提高高多花黑黑麦草胚胚性愈伤伤组织的的形成26。在国国内，张张万军等等（20003）在试验验中发现现，蔗糖糖在黑麦麦草的分分化中起起着重要要的调节节作用，低于33的蔗蔗糖不利利于黑麦麦草的分分化227。胡张华华等（220033）在对对狗芽根根的组织织培养中中发现，在继代代培养基基中

15、提高高蔗糖和和琼脂浓浓度，有有助于改改善愈伤伤组织状状态，促促进胚性性愈伤组组织的发发生与植植株再生生288。刘刘文真等等的实验验也表明明蔗糖的的使用提提高了多多年生黑黑麦草的的再生频频率119。以上结结果表明明，禾本本科草不不同于禾禾谷类作作物，碳碳水化合合物添加加物以蔗蔗糖为主主，同时时，高浓浓度的蔗蔗糖有利利于提高高再生频频率和促促进胚性性愈伤组组织的发发生。2. 原原生质体体的制备备及植株株再生在遗传转转化中，首先诱诱导和分分离胚性性愈伤组组织，然然后建立立胚性悬悬浮培养养物，再再从胚性性悬浮培培养物中中分离原原生质体体进行转转化试验验。虽说说胚性愈愈伤组织织已直接接作为结结缕草遗遗传

16、转化化的目标标材料，但是原原生质体体是以往往成功的的转化试试验中采采用最多多的材料料299。因因此，原原生质体体作为基基因转化化的主要要受体，它的制制备和培培养也是是相当重重要的。首先，将将诱导生生成的胚胚性愈伤伤组织转转入液体体培养基基，小心心地分散散，在摇摇床上振振荡培养养，即可可获得快快速生长长的悬浮浮细胞。然后，利用水水解细胞胞壁的水水解酶类类，可以以除去悬悬浮细胞胞的细胞胞壁，获获得原生生质体。一般来来说，制制备感受受态的原原生质体体需选用用来自于于胚性愈愈伤组织织、分散散好、处处于对数数生长期期的悬浮浮细胞，因为它它们是牧牧草中提提供具有有细胞全全能性的的原生质质体的唯唯一来源源3

17、00。原生质体体培养与与细胞培培养类同同，主要要差别是是原生质质体除去去了细胞胞壁，需需要一定定浓度的的渗透压压稳定剂剂来保持持原生质质体的稳稳定，一一般用加加以改良良的细胞胞培养基基，如：加入LL一脯氨氨酸和渗渗透物质质如甘露露醇、PPEG一一60000等，有利于于维持原原生质体体的形态态。培养养基除了了提供必必需的营营养元素素外，生生长调节节剂、渗渗透压和和培养基基对细胞胞数的比比率以及及其他环环境因素素均影响响原生质质体的植植板率(plaatinng eeffiicieencyy)和再再生66。有关从从细胞悬悬浮液分分离出原原生质体体的报道道，最早早是在多多年生黑黑麦草上上311。悬悬浮

18、细胞胞培养和和原生质质体培养养不仅仅仅在黑麦麦草和高高羊茅上上进行，在别的的草上也也有相关关报道，如鸭茅茅、巴哈哈雀稗、匍匐翦翦股颖、草地早早熟禾、日本结结缕草等等。植物原生生质体在在合适的的培养条条件下，可以再再生细胞胞壁，进进行细胞胞分裂，形成细细胞团及及愈伤组组织，进进而并通通过不同同的形态态发生途途径再生生形成完完整的植植株。由由原生质质体培养养获得再再生植株株最早是是Daltton（19888）在在高羊茅茅上进行行研究的的322。TTakaamizzo等（19990）改改进了原原生质体体的培养养系统，高羊茅茅植株再再生频率率从9.6%提提高到了了40-70%333。WWangg等19

19、993年年利用草草地羊茅茅原生质质体获得得了可育育的再生生植株，再生频频率为220-330%34。对于于多年生生黑麦草草，其细细胞悬浮浮液产生生的原生生质体培培养，首首先由DDaltton（19888）进进行报道道的332；而其产产生再生生植株的的实验是是由Crreemmerss等于119899年进行行的335。3. 遗遗传转化化的常用用途径：有4种转转基因方方法用于于遗传转转化：原原生质体体DNAA吸收(DDNA upttakee byy prrotooplaast)、微粒粒子轰炸炸 (ppartticlle bbombbarddmennt，Bioolissticc)、碳碳化硅介介导的DDN

20、A发发送(ssiliiconn caarbiide fibber-meddiatted DNAA deelivveryy)和农农杆菌介介导的转转化(AAgroobaccterrlummmeddiatted traansfformmatiion)。 3.1原原生质体体DNAA吸收将DNAA直接发发送到原原生质体体获得转转基因植植物是牧牧草及草草坪草成成功转化化的主要要方法之之一。这这种方法法的原理理是：原原生质体体能从周周围介质质中高效效吸收质质体DNNA，在在培养物物中加PPEG(聚乙烯烯乙二醇醇)或采用用电穿孔孔（电击击法）(eleectrropoorattionn)技术术促进原原生质体体吸

21、收外外源DNNA；利利用PEEG或电电击法或或两种方方法联合合使用，可使吸吸收率大大大提高高，这样样就能获获得更为为适合的的原生质质体植物物的再生生系统，同时，可以得得到大量量转基因因的克隆隆体，这这些克隆隆体在大大多数情情况下，都能发发育成可可育的转转基因植植物336。在多数情情况下，由原生生质体转转移得到到的转基基因植物物在一定定染色体体位点上上，优先先表现出出外来基基因的稳稳定遗传传性337。在牧草草中，HHornn等第一一个报道道了从原原生质体体获得转转基因植植物鸭茅338。INOOKUMMA（119988）等利利用原生生质体吸吸收法将将潮霉素素磷酸转转移酶(hptt)基因因导人日日本

22、结缕缕草并获获得转基基因植株株399。虽虽说原生生质体介介导的转转化已在在许多牧牧草及草草坪草中中获得了了成功，但是，通过原原生质体体再生植植株仍然然很困难难，在直直接向原原生质体体转基因因的基础础上，两两种质体体联合转转化产生生可识别别和不能能识别基基因的几几率很高高400，并并且不育育的问题题、多拷拷贝基因因的整合合以及转转基因的的重排、原生质质体培养养过程中中严重的的细胞遗遗传方面面的干扰扰导致的的体细胞胞无性系系变异，仍然限限制这一一方法的的应用。同时针针对原生生质体转转基因牧牧草及草草坪草的的遗传细细节研究究，以及及关于相相应的外外源DNNA在减减数分裂裂时的稳稳定性，到目前前为止还

23、还不是很很清楚，只有知知道了一一些相关关的特征征，直接接向原生生质体转转移基因因的技术术方法才才能成为为研究瞬瞬时基因因表达的的有利工工具。3.2 微粒子子轰炸（基因枪枪转化）所谓基因因枪转化化就是通通过高速速飞行的的金属颗颗粒将包包被其外外的目的的基因直直接导入入到受体体细胞内内，对抗抗生素（潮霉素素）和遗遗传因子子产生抗抗性的基基因被选选做选择择标记，并由此此产生了了严密的的选择系系统，从从而实现现基因转转化的方方法。KKleiin 等等早在119877年发现现，可以以利用钨钨粒子将将携带标标识基因因的DNNA导入入葱属植植物的表表皮细胞胞，并在在碰撞中中产生瞬瞬时基因因表达42。在20世

24、纪纪80年代代末期，美国康康奈尔大大学的SSanffordd教授最最先提出出这一方方法，该该方法主主要是为为了克服服以往各各种基因因转化技技术的局局限，如如农杆菌菌转化的的宿主限限制、PPEG法法或电击击法转化化所必需需的繁杂杂的原生生质体培培养工作作，因而而在转基基因研究究中得到到了极广广泛的应应用441。目前，微微粒子轰轰炸技术术已成功功应用于于许多禾禾本科草草的遗传传转化中中。19995年年，Sppanggenbbergg等人首首先用基基因枪转转化法得得到黑麦麦草转基基因植株株433。随随后，AAHN等等利用基基因枪法法获得了了日本结结缕草转转基因植植株444。在国内内，霍秀秀文等（20

25、004）以以幼穗为为外植体体建立了了冰草组组织培养养再生体体系，并并将除草草剂抗性性基因bbar用用PDSS 10000He基因因枪导入入了在内内蒙古地地区有一一定面积积并具推推广前景景的优良良牧草蒙蒙农杂种种冰草，获得了了转基因因植株，初步建建立了冰冰草遗传传转化体体系，遗遗传转化化率为11.12。虽然然认为微微粒子轰轰炸适合合于每一一个物种种，但其其也有类类似于原原生质体体DNAA吸收法法的缺点点，由于于外源基基因整合合的复杂杂性，获获得稳定定遗传的的转基因因植株也也有较大大的困难难411。3.3碳碳化硅介介质传递递（碳硅硅纤维漩漩涡介导导法）质体DNNA能通通过碳化化硅介质质传递到到完整

26、的的悬浮培培养细胞胞上，悬悬浮培养养细胞与与DNAA和针状状的碳硅硅纤维混混合在一一起，使使碳硅纤纤维和悬悬浮细胞胞发生碰碰撞，并并导致细细胞的渗渗漏、DDNA的的吸收和和植物细细胞稳定定转移45。这样样，从这这个转移移细胞中中，转基基因植物物得以修修复446。Asaano等等在19991年年，研究究了Aggrosstiss allba L.接触触悬浮细细胞的碳碳化硅介介质转移移GUSS基因后后瞬时表表达特性性的研究究，当悬悬浮细胞胞在指数数生长阶阶段进行行转基因因，GUUS基因因表达中中心的数数目最高高，当复复制时被被传染，GUSS表达水水平是较较高的47。Dalltonn等在119988年

27、利用用碳化硅硅介质转转移技术术，获得得了几株株转基因因植物多多花黑麦麦草和一一株单基基因型的的多年生生黑麦草草500。利利用目前前的原始始技术，对大量量细胞进进行修饰饰的结果果及其限限制性因因素表明明：以碳碳化硅为为介质的的转移方方法或许许不如微微粒子轰轰炸转移移技术理理想和廉廉价。但但是，通通过Aggrobbactteriium为为介质的的转基因因技术，在大米米、玉米米、小麦麦、豆类类作物上上成功的的获得了了转基因因再生幼幼苗449,551,552，这为挖挖掘在培培养牧草草、草坪坪草转基基因植物物的潜力力做出了了贡献。3.4 农杆菌菌介导的的转化与上述三三种方法法相比，农杆菌菌作为一一种天然

28、然的植物物基因转转化系统统，具有有转化的的外源DDNA结结构完整整、转化化机理清清楚，整整合位点点较稳定定、拷贝贝数低、整合后后的外源源基因结结构变异异较小等等优点，因而倍倍受重视视。农杆杆菌转化化植物的的研究始始于200世纪800年代初初，自RRobeert创创建了叶叶盘法以以后，在在双子叶叶植物中中得到了了广泛应应用441。农杆菌菌介导的的遗传转转化主要要的两个个关键影影响因素素：转化化受体(愈伤组组织)与农杆杆菌的互互作状态态。一般般采用农农杆菌介介导感染染10 raiin进行行转化。愈伤组组织的不不同生长长状态对对转化频频率有直直接的影影响，具具备强分分裂能力力的感受受态细胞胞是转化化

29、的基本本条件48。遗憾憾的是，单子叶叶植物不不属于农农杆菌固固有的寄寄主范围围但是是，自从从19994年日日本在水水稻上证证实农杆杆菌技术术可行以以来449，农杆菌菌技术在在重要的的单子叶叶植物，如水稻稻、玉米米和大麦麦上的应应用快速速发展。同时，令人可可喜的是是， IIANGG等首次次利用农农杆菌介介导转化化方法感感染日本本结缕草草愈伤组组织，获获得转基基因植物物，愈伤伤组织GGus显显色可达达到600%。最最近，郭郭振飞和和卢少云云也试探探用农杆杆菌介导导法开展展结缕草草转基因因研究并并获得初初步结果果488。这这些都为为该技术术在牧草草及草坪坪草上的的应用提提供了进进一步的的参考。4.存

30、在在的问题题及发展展前景人们已经经认识到到了生物物技术在在改良牧牧草及草草坪草品品种上具具有的潜潜力。虽虽然在近近期的育育种工作作中，很很多牧草草和草坪坪草植物物得以改改良，然然而在改改良特异异品质方方面的进进展却十十分缓慢慢。目前前，在草草地的生生产与运运用中仍仍然存在在许多问问题，如如：如何何运用分分子标记记技术进进行选择择；如何何根据转转基因技技术将单单个的有有价值的的基因进进行转移移，从而而评价其其可能的的生产潜潜力；怎怎样产生生新的遗遗传变异异和新的的有用的的品质，从而更更好的应应用先进进的育种种技术改改良植物物的品质质。同时时，转基基因草类类的生物物安全性性也是一一个值得得关注的的

31、问题。可以这样样说，生生物技术术是一把把双刃剑剑。随着着现代生生物技术术的发展展，必将将有越来来越多的的转基因因草类问问世，给给我们的的经济建建设和人人类生活活带来极极大的益益处。参考文献献1 Vann Wiijk AJPP, BBoonnmann JGG, RRumbballl W. Acchieevemmentts aand proospeectiivess inn thhe bbreeedinng oof fforaage graassees aand leggumeesMM. Im: Baakerr MJJ(edd) GGrassslaandss foor oour worrld. S

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41、olliumm peerennne L.，andd L. muultiifloorumm LaamJJ.PPlannt CCelll Tiissuue OOrgaan CCultt，19888,112:1137140018 王铖铖，李青青，辛燕燕.高羊羊茅种子子愈伤组组织诱导导及植株株再生研研究JJ. 北京林林业大学学学报，20004，226（11）：666-66919刘文真真，玄松松南，陈陈惠哲等等.几种种作用因因子对多多年生黑黑麦草组组织培养养影响的的研究J.林业科科学研究究，20004，17（1）：95-101120 Brronssemaa F B FF, vvan Oosstveeen

42、 W JJ F，vann Laammeerenn A A MM. IInflluennce of 2,44-D，TIBBA aand 3，5-DD onn thhe ggrowwth ressponnse of cullturred maiize embbryoosJJPlaant Celll TTisssue Orggan Cullt，20001，65：455621 Shhettty KK, AAsanno YY. TThe infflueencee off orrgannic nittroggen souurcees oon tthe indducttionn off emmbryyoge

43、enicc caalluus iin AAgroostiis aalbaa L.JJ PPlannt PPhyaaioll,199911399：828522 吴关关庭，胡胡张华，陈锦清清.高羊羊茅和其其他羊茅茅植株再再生与遗遗传转化化研究进进展JJ.植植物学通通报，220044，211（2）：1446-115523 Arrtunnduaaga I RR,Taaliaafrrro CC M,Johhnsoon BB B.Efffectts oof aauxiin cconccenttrattionn onn emmbryyogeenicc caalluus iinduuctiion froom

44、cculttureed yyounng iinflloreesceencees oof oold worrld bluue sstemms(BBothhrioochlloa sppp.)aand berrmuddagrrassses(Cyoodonn sppp.)J. PPlannt CCelll Tiissuue OOrgaan CCultt,19988,12:13-1924 孙宗宗修，斯斯华敏，程式华华，等麦芽糖糖提高水水稻花药药培养效效率的研研究JJ中中国水稻稻科学，19993，7(44):2227-231125 Zaaghmmoutt OMMF,TToreelloo WAA.Reest

45、oorattionn off reegenneraatioon ppoteentiial of lonng-ttermm cuultuuress off reed ffesccue(fesstucca rrubrra LL.)bby eelevvateed ssucrrosee leevellsJJ. Plaant Celll RRep,19992,111:1142-145526Dalltonn SJJ,Thhomaas IID. A sstattistticaal ccomppariisioon oof vvariiouss faactoors on embbrvoogennic prool

46、ixxferratiion, moorphhogee-nesiis aand reggeneerattionn inn Looliuum ttemuulenntumm ceell susspennsioon ccoloonieesJJ. Plaant Celll TTisssue Orggen Cullturre,119922,300:155-29927 张万万军，王王涛.多多年生黑黑麦草组组织培养养与植株株再生研研究JJ.草草地学报报，20003，11（3）：2199-222228 胡张张华，陈陈火庆，吴关庭庭等.百百慕大成成熟胚的的组织培培养及植植株再生生J.草业业学报，20003，112

47、（11）：885-88929 柴明明良.草草坪转基基因研究究进展J.科技通通报，220022，188（1）：677-72230Pottrykkus I, Shiilliito RD. Prrotooplaastss: iisollatiion, cuultuure, pllantt reegenneraatioonJJ. Metthodds EEnzyymoll, 119866，1118:5549-578831Jonnes MGKK, DDalee PJJ. RReprroduucibble reggeneerattionn off caalluus ffromm suuspeensiion

48、cullturre pprotto-pplassts of thee grrasss Looliuum ttemuulenntummJ. ZZ Pfflannzennphyysiool, 19882，1105:2677-277432Dalltonn SJJ. PPlannt rregeenerratiion froom ccelll suuspeensiion prootopplassts of Fesstucca aarunndinnaceea SSchrreb., LLoliium perrennne LL. aand L. mulltifflorrum Lamm. J. Pllantt

49、Ceell Tisssuee Orrgenn Cuultuure,19888,112:1137-140033 Taakammizoo T, Suuginnobuu KII, OOhsuugi R. Plaant reggeneerattionn frrom susspennsioon ccultturee deerivved prootopplassts of talll ffesccue (Feestuuca aruundiinaccea Schhredd.) of a ssinggle gennotyypeJ. Pllantt Scci, 19990,772:1125-131134 Waa

50、ng ZY, Vaall MP, Moontaavonn P, ett all. FFerttilee pllantt reegenneraatioon ffromm prrotooplaastss off meeadoow ffesccue (Feestuuca praatennsiss Huuds.) J.Plaant Celll RRep, 19993,12:95-100035 Crreemmerss-Moolennaarr J, Vaan dder Vallk PP, LLoefffenn JPPM, et al. Pllantt reegennerttionn frrom sussp

51、ennsioon ccultturees aand prootopplassts of Lolliumm peerennne L. J. Pllantt Scci, 19889,663:1167-176636Davvey MR, Reech EL, Muulliigann BJJ. DDireect DNAA trranssferr too pllantt ceellssJ. PPlannt MMol Biool,119899,133:2773-2285. 37 Pootryykuss I, Paaszkkowsski J, Sauul MMW, et al. Moolecculaar aan

52、d genneraal ggeneeticcs oof aa hyybriid fforeeignn geene inttrodduceed iintoo toobaccco by dirrectt geene traansfferJ. Mool GGen Gennet,19885,1199:1677-177738 Hoorn ME, Shhiliito RD, Coongeer BBV, et al. Trranssgennic plaantss off orrchaardggrasss(DDacttyliis gglommeraata L.)froom pprottopllasttsJJ.

53、 Plaant Celll RRep,19888,77:4669-4472 39 INNOKUUMA C，SUGGIURRAK，IMAAIZUUMI，et alTraansggeniic JJapaanesse llawnngraass(Zoyysiaa jaaponnicaa Stteudd.)pplannt rregeenerrateed ffromm prrotooplaastJPlaant Celll RRep，19998，17：3344338840 Scchoccherr RJJ, SShillitoo RDD, SSaull MWW, eet aal. Co-traansfform

54、matiion of unllinkked forreiggn ggenees iintoo pllantts bby ddireect genne ttrannsfeerJJ. Bioo Teechnnoloogy, 19986,4:110933-1009641 何勇勇，田志志宏.草草坪植物物遗传转转化研究究进展.生物技技术通讯讯，20003，14（6）：5399-544242 Klleinn TMM， WWolff EED， Wu R，SSanffordd JCC. HHighh veeloccityy miicrooproojecctilles forr deelivveriing nuccleiic aacidds iintoo liivinng ccelllsJJ. Natturee, 119877,3227:770-77343 Sppanggenbbergg G，Wanng ZZ Y，Wu X LL，Naggel J，Pottryuus IITraansggeniic ppereenniial ryeegraass(Lolliumm peerennne)plaantss frrom miccrobbarddmennt oof eembrryoggeniic ssusppenssionn ceellssJPlaant Scii