临床免疫学检验：免疫细胞的分离与检测

1、1Separation and Assays of Immunocyte第十四章 免疫细胞的分离与检测 2免疫细胞指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞。主要分为以下三类：1、淋巴细胞：T细胞、B细胞、NK细胞2、抗原提呈细胞：包括血液中单核细胞和各种组织中的巨噬细胞、树突细胞3、其他细胞：包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、红细胞等。3T lymphocyteB lymphocyte淋巴细胞4单核细胞巨噬细胞5粒细胞red blood cellT lymphocyteBasophils are nonphagocytic granulocytes67免疫细胞的来源和分离目的1

2、、目前可以从外周血、骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结、组织等部位2、检测免疫细胞的数量和功能，评价机体免疫状态；用于临床治疗；免疫细胞的生物学研究等8免疫细胞的分离与纯化(掌握)淋巴细胞的数量检测（熟悉）9外周血免疫细胞分离的步骤及目标抗凝血CD5-CD5+CD4+CD8+B细胞T细胞单核细胞淋巴细胞粒细胞单个核细胞血小板红细胞白细胞血浆细胞10细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同 11白细胞的分离单个核细胞的分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离淋巴细胞亚群的分离吞噬细胞的分离细胞分离分离细胞的保存和活力测定12白细胞的分离一、自然沉降法原理：利用红细胞

3、与白细胞的沉降速度不同，红细胞自然沉降率较快，可用自然沉降法分出白细胞层和红细胞层。红细胞白细胞血浆13二、高分子聚合物沉降法原理：利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。 14外周血单个核细胞的分离-密度梯度离心法原理：外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，为此利用用一定的介质在管中形成单次密度梯度、连续或不连续的密度梯度，将细胞悬液置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层分离。红细胞和多核白细胞密度较大，为1.092左右单个核细胞（淋

4、巴细胞和单核细胞）的密度为1.0761.090血小板为1.0301.035。15常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。 Ficoll分离液法Percoll分离液法16 Ficoll分离液法 是一种单次密度梯度离心分离法分层液：聚蔗糖泛影葡胺分层液 主要成分：1、聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、基本等渗、无毒性的特点。 2、泛影葡胺（urografin）：用以增加密度。分离人外周血单个核细胞的分层液最佳密度为1.0770.00117用1.0770.001的分层液可将细胞分离 18淋巴细胞的分离一、红细胞的去除：低渗裂解法二、血小板的去除：离心洗涤三、单核细

5、胞和粒细胞的去除A、 Percoll分离液法（连续密度梯度离心） B、粘附贴壁去除法C、吸附柱过滤法D、羰基铁粉吞噬法19A、Percoll分离液法是一种连续密度梯度离心分离法，用于纯化单核细胞和淋巴细胞。主要成分：Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。原理：利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度（分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度），从而将密度不等的细胞分离纯化。20密度递减分离液 稀释的血液21B、粘附贴壁去除法单核细胞（贴壁）淋巴细胞（非贴壁）37度温箱1小时22C、吸附柱过滤法淋巴细胞葡聚糖凝胶单核细胞、粒细胞23D

6、、羰基铁粉吞噬法37度温箱摇动10分钟单核细胞淋巴细胞24T细胞和B细胞的分离E花环分离法尼龙棉柱分离法25一、E花环分离法原理：T细胞表面有特异性绵羊红细胞（SRBC）受体，因此T细胞能与绵羊红细胞结合形成一玫瑰花样的花环，称为E花环。 Ficoll分离液B细胞T细胞26二、尼龙棉柱分离法原理：本法利用B细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。37度温箱1小时27淋巴细胞亚群的分离 亲和板结合分离法 免疫磁珠分离法 补体细胞毒法 流式细胞仪分离法 28一、亲和板结合分离法 利用淋巴细胞亚群有不同的表面标志物的特点加以选择性分离。直接法：先将相应抗体结合于反应板上，再将细胞悬液

7、加到反应板上，抗原阳性细胞便与相应抗体反应而被吸附。间接法：2930羊抗鼠IgG(二抗）鼠抗人单克隆抗体31二、免疫磁珠分离法32免疫磁珠法分为正选法和负选法 正选法磁珠结合的细胞就是所要分离获 得的细胞负选法磁珠结合不需要的细胞，游离于 上清液的细胞为所需细胞技术类型：直接法、间接法33免疫磁珠法细胞分选过程34三、补体细胞毒法+补体受检淋巴细胞单克隆抗体35 吞噬细胞的分离和收集1、可通过Percoll梯度密度分离法：获取人外周血中单核巨噬细胞2、斑蝥敷贴法：从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞3、从小鼠、大鼠、豚鼠等小动物获取巨噬细胞：腹腔注入石蜡油，3-4天后收获腹腔渗出液36分离细胞的保

8、存及活力测定 （一）短期保存技术 将分离到的细胞用适量含1020灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬，4度保存。（二）长期冷冻保存技术 利用液氮深低温（196）环境保存细胞冷冻保护剂：二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）371、冻存细胞悬液2、降温:两步降温法（慢速降温） 80低温冰箱过夜 196液氮深低温保存3、解冻：要求20秒内完全融化 （快速解冻）38细胞活力测定台盼蓝（trypanblue）染色法：这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈

9、蓝色。活细胞率（活细胞/细胞总数）X100%39淋巴细胞的数量检测一、 T细胞数量的检测二、 B细胞数量的检测三、NK细胞数量的检测40T细胞表面标志物 T细胞表面主要CD抗原及其特异性CD抗原 特异性CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞CD3 成熟T细胞CD4 T（h/d)细胞、M、HIV受体CD8 T（c/s)细胞、NK细胞的亚型CD25 活化T细胞、IL-2受体CD28 活化T细胞CD45 RA/RO41一、T细胞数量检测 花环技术免疫荧光法 免疫组织化学法微量细胞毒试验可溶性抗原肽-MHC四聚体复合物法 E花环试验葡萄球菌花环法抗体致敏细胞花环法42E花环试验花环形成试验。图中箭头

10、所指为T淋巴细胞形成的E花环 镜检计数花环形成率43葡萄球菌花环法SPA细胞IgG44抗体致敏细胞花环法+致敏SRBC+CD8单克隆抗体计数花环百分率，即为CD8阳性细胞百分率454647微量细胞毒试验+补体伊红染色受检淋巴细胞单克隆抗体48可溶性抗原肽MHC四聚体技术49二、B细胞数量的检测 B细胞表面有膜免疫球蛋白（mIg)、CD抗原、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体等标志。1、SmIg的检测2、 CD抗原检测3、 Fc受体和补体受体的检测：EA、EAC花环4、小鼠红细胞受体的检测50SmIg的检测表面膜免疫球蛋白：B淋巴细胞表面存在的一种特有的免疫球蛋白。可分为IgG、

11、IgA、 IgM、 IgD、 IgE。 外周血淋巴细胞： mIgM、 mIgD 检测方法：免疫荧光法、酶免疫组化法、流式细胞仪等51CD抗原的检测 B细胞表面抗原有CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等分化抗原，有些是全部B细胞所共有，而有些仅是活化B细胞特有，据此可用相应的系列单克隆抗体，通过免疫荧光法、酶免疫组化法、流式细胞仪等加以检测。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 表面标志 B1 B2 CD5 + - CD19 + + 52人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。检测方法：免疫荧光法、酶免疫组化法、流式细