分光光度技术简介

1、PAGE PAGE 131分光光度技术简介6.1 基本原理利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。1. 光谱：光是电磁波，可用波长“”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是二个相邻的波峰之间的距

2、离。光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。 C/波长 C光速 频率，单位时间通过一个定点的波数。光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：EhH普朗克常数（ 6.62410-27尔格秒）频率紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm400nm。可见光区为400nm800nm。组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分

3、子的能量可以写成：EE0+E平+E转+E振+E电E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：EE2- E1hE1、E2分别

4、表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，E0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E0.051.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大， E120 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子

5、被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。与吸收光谱有关的三种电子是： 二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称 键， 构成 键的电子称 电子，如CC、CH键。 平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称 键，形成键的电子称为 电子，如C=C键。 未共享成键的电子，称n电子。各种电子跃迁所需能量大小的顺序是：n* n*紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的电子和未共享的电子对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的

6、共轭情况等。如下表所示： 电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系表电子跃迁类型 例 子紫外吸收波长范围* CH 100150 nm *( 非共轭 ) CO 200 nm *( 共轭 ) CC 200300 nm n* CO 300 nm *跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200300 nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长作横

7、坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A”或“T”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。吸光度 A D C B max min 波长(nm) 由上图可以看出吸收光谱的特征：曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以max表示。曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以min 表示。曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。max是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，max、min、

8、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，

9、因此在鉴定时应与红外光谱相结合。由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n*、*、 n* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：CC、CO等发色团。助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生 n*

10、 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。增色效应（hyperchromic effect）:核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。减色效应（hypochromic effect）:在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时值又明显减少，回复到原来的核酸分子值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。2. 光吸收定律：朗

11、伯比尔（Lambertbeer）光吸收定律： AlgTb cA吸光度，又称光密度“O.D”。T透光度， TI / I。， I。为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强。摩尔吸光系数或克分子吸光系数（Lmol1cm1）。b样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。C样品浓度（mol/L）。由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“”和物质的浓度“C”成正比。摩尔吸光系数： ， 是物质对某波长的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。值越大，说明电子跃迁的几率大，通常 10105：一般认为 104为强吸收；103104 为较强吸收； 10

12、2 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A0.001, 所以，当b1cm, 105时，可检测的溶液最小浓度是C10-8 mol/L。常用的吸光系数还有一种百分吸光系数，即在某一波长下，溶液浓度为1%（W / V），液层厚度b1cm时的吸光度，以E1%max表示。C百分浓度（W / V）。L液层厚度，吸收杯光径长度。 A吸光度。最大吸收波长max时的 和E1%max值可用下式换算： E1%max分子量 / 10吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：A1C1b12C2b23C3b3即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混

13、合物分光光度法定量分析的基础。若溶液中各溶质的吸光系数相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例如，离子交换柱层析分离核苷酸实验中可利用吸光度计算回收率：mCV ， ， m溶质的量 C溶质浓度V溶液体积 A吸光度吸光系数 b吸收池光径 回收率（100%） （上式中假设总和各核苷酸的近似相等）例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 = 8.2103 M1cm1（Mmol / L）。 A bC A（溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度） A0.6500.0700.58

14、0 b1cm C=7.1105 mol / L 例二：1%（W/V，10 mg / ml）酪氨酸酶溶液的吸光度为24.9（1cm吸收池，280nm），计算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的浓度。由于这两种酶溶液的百分吸光系数“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法计算浓度。 C未知0.010.1mg / ml6.2 分光光度计的组成和构造：1. 组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：（1）光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接收检测放大系统；（5）显示或记录器。光 源 单色器 样品室 检测放大系

15、统 显示器国产分光光度计近年来已有很大的发展，各种档次的分光光度计都已更新升级换代，可见光系列有：721、722、723等型号，紫外/可见光系列有：751、752、753、754、756等型号，主要生产厂为上海分析仪器总厂等。我系1985年购买的瑞士KONTRON康强公司生产的UNICON 860型紫/可见光分光光度计，是双光束、快速自动扫描、荧屏显示的高档分光光度计。这种双光束分光光度计的特点是来自光源的连续光谱经凹面全息光栅分光后，由出射狭缝得到单色光，经过由电机带动的25周/秒左右的旋转镜分解为“样品”、“参比”光束，顺序分时通过参比池和样品吸收池，照射到光电倍增管上，由于两条光路是几乎

16、同时测量，参比信号又不断与标准电压比较，使参比信号恒定，所以由光源、单色器、外界杂光、光电倍增管以及电源电压等带来的影响，仪器均能自动消除。最快波长扫描速度为1200nm/min，有五种测量功能和五种数据处理功能。我系2000年购买的德国耶拿（蔡司）公司生产的SPECORD 200型高档紫外/可见光分光光度计的光路原理图如下：SPECORD 200分光光度计的样品和参比光路，分别有各自的带温控的光电二极管检测器，因而取消了电机带动的旋转镜，大大提高了仪器的稳定性及各项检测指标，其波长范围是190nm1100nm，吸光度测定范围是03A，可变狭缝宽度为1nm、2nm和5nm，仪器使用微机控制时，

17、扫描速度最高可达6000nm/min，宽大的样品室可以安装各种附件，仪器性能优良，适合教学、科研使用。该仪器的使用说明详见附录。2. 构造： 光源：理想光源的条件是：能提供连续的辐射；光强度足够大；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是3201100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适用波长范围是195400nm，由于氘灯寿命有限，

18、国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。 单色器：单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是：入射狭缝限制杂散光进入。色散元件即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。准直镜把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。 出射狭缝只让额定波长的光射出单色器。转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。光栅：光栅有透射光栅和反射光栅，实际应用的都是反射光栅，它又可分为平面反射光栅（即通称的反射光栅或闪烁光栅）和凹面

19、反射光栅两类，凹面反射光栅可以起色散元件和准直镜两个作用，使色散后的光束聚焦于出射狭缝，得到锐线光谱。光栅的刻制方法有两种：机刻光栅：用金刚刀挤压镀于硬质玻璃上0.51的铝反射层而得。刻制工作量极大，一般每分钟只能刻10条线，刻100mm宽的600线/mm的光栅要100小时。最多刻到3600线/mm。由于其制造周期长，成本高，一般只能制得少量的母光栅，而实际应用的多是复制光栅，即在母光栅上涂上硅油，再镀上一层铝，用环氧树脂粘下来，就得到复制光栅。机刻光栅的缺点是线槽稍有缺陷时就会出现“鬼线”，即位于光谱强线两侧的模糊不清的假线。 全息光栅：用全息照相法刻制的高精度光栅。即用高强度的相干性极好的

20、单色光，如激光，用高分辨的感光材料光致抗蚀剂记录干涉条纹，曝光1小时，化学处理掉受光部分，再进行真空镀膜（镀铝），得到全息反射光栅。这种光栅几乎没有线槽间的周期误差，几乎没有“鬼线”，杂散光很少。最大线槽密度可达6500线/mm，最大直径可达400mm，刻线越多，分辨率就越高，最常用的是12001500线/mm的全息光栅。狭缝、光谱频带宽度和分辨率：出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以毫微米nm表示。例如，出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱

21、带宽。纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能得到的“单色光”，实际上只是具有一定波长范围的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。 对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度也就越弱，因此狭缝不能无限制地小，狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。目前达到的最小宽度为0.1nm。光谱有效频带宽度“b”是检测器检测到的光能量为峰值一半处的二点间的波长间隔，如下图所示： 光强度 Pb 光谱有效频带宽（nm）b 狭缝宽度（mm） 1/2h 线色散率 b 光谱有效频带宽b d波长差 1/2hdS出射狭缝平面上二条 波长 光线（d）所分开的距离（mm） 由上式可以看出，b与b成正

22、比， 与线色散率成反比。线色散率越大，则可得到的有效频带宽度越小。分辨率：是仪器对相邻的两个峰可分辨的最小波长间隔，是仪器分辨邻近二条谱线的能力。分辨率 ： 例如若可分开钠双线：则 高的分辨率可达：R=105。所以，狭缝宽度b越小，光谱带宽b越小，分辨率就越高。何种情况算是能够分辨：定义为二条谱线的峰与谷处于同一位置时，此二个峰认为是刚好能分辨。由于光栅分光其色散是线性的，所以只用一种狭缝宽度对各种波长的光的测量，其分辨率都相同，即狭缝宽度不必经常调节。只要光强能达到要求，应使用尽可能小的狭缝宽度，以提高分辨率。 样品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒

23、温池架，恒温池架有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为 0.1，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达 0.05。吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm3000nm。吸收池的形状有长方形，方形和园筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml），光程要求极精确，透光的玻璃面要严格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭头“”，标明杯子使用时的透光方向，反方向使用

24、会有偏差。有各种用途的石英吸收池：如液体池、气体池、微量池（容积5l1ml）、流动池（测量连续流动的样品）、长光径池（测量稀溶液用）、可装拆池（便于清洗）等。石英杯通常还配有玻璃或塑料盖，用以防止样品挥发和氧化，以及杯内样品的快速混合。吸收池使用注意事项： 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹

25、干。决不可用超声波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为：A= A1A0 高档的分光光度计有自动置零系统，可将二个杯子的偏差置零。其他重要附件：高档分光光度计的样品室还可以更换各种重要附件，用于各种特殊量测。如换上“积分球”，可用来检测微弱透光和不透光的样品。换上“凝胶扫描装置”，可用于电泳凝胶胶条上样品带的扫描测量。 检测器：检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。光电管：光电管可检测10微微安（10-11A）的光电流，管内抽真空充入惰性气体，常用国产真空光电管有GD-5兰敏光电管（适用波长为210625nm）；GD-6红敏光电