【翻译】【独家首发】抗氧化剂硫辛酸的药理作用

1、综述抗氧化剂硫辛酸的药理作用Gerreke Ph. Biewenga, Guido R. M. M. Haenen* and Aalt Bast莱顿/阿姆斯特丹药物研究中心，VRIJE大学，药物化学系，分子药理学部， DE BOELELAAN，1083, 1081 HV 阿姆斯特丹, 荷兰 : 31-20-4447610; : 31-20-4447582摘要 1.硫辛酸是目前现有的治疗作用与抗氧化活性相关的药物中的一个范例。 2. 抗氧化活性是一个相对概念：它取决于氧化应激的种类以及易被氧化底物的种类如DNA，脂类，蛋白质等。3硫辛酸在体外最终的抗氧化作用是由其浓度及抗氧化特性所决定。其抗氧化

2、特性包括：金属螯合能力，活性氧自由基去除能力，再生内源性抗氧化剂的能力及修复氧化损伤的能力。4. 二氢硫辛酸 (DHLA)是由复原硫辛酸而生成，其抗氧化能力比硫辛酸更强。DHLA和硫辛酸均具有金属螯合和ROS去除作用，但只有DHLA能够再生内源性抗氧化剂和修复氧化损伤。5. 作为金属螯合剂，硫辛酸通过螯合Fe2+ 和Cu2+离子发挥抗氧化作用，而DHLA通过螯合Cd2+离子产生抗氧化活性。6. 作为ROS去除剂，大多数试验的结果均观察到硫辛酸和DHLA的抗氧化作用，然而在特定情况下也观察到它们的促氧化活性。但是，硫辛酸可以作为抗氧化剂能够对抗DHLA的促氧化作用。7. DHLA能够再生内源性抗

3、氧化剂，如维生素E，维生素C及谷胱甘肽。 8. DHLA可以为肽甲硫氨酸亚砜复原酶提供复原当量。该作用有助于增强氧化损伤蛋白的修复，如1-抗蛋白酶。9. 通过硫辛酰胺脱氢酶介导的硫辛酸复原作用，除NAPDH库外，细胞还可以依靠NADH库发挥抗氧化功能，该NADH库在氧化应激反响通常被大量损耗。10. 在药物相关的抗氧化剂药理学中，硫辛酸是一种模式化合物，增进了人们对抗氧化剂在药物治疗中作用方式的了解。GEN PHARMAC 29;3:315-331, 1997. 1997 Elsevier Science Inc.关键词 抗氧化剂药理学，二氢硫辛酸，谷胱甘肽，硫辛酸，新陈代谢，金属螯合作用，肽

4、甲硫氨酸亚砜复原酶，活性氧自由基，去除，维生素C，维生素E抗氧化剂药理学在药理学中，抗氧化剂药理学是人们关注的一个新的研究领域。然而在20世纪初， P. Ehrlich指出大局部药物是通过与DNA或蛋白质受体，酶，载体分子，离子通道结合而发挥作用。最近以来，药物影响机体功能的其它机制正为人们所接受,作为抗氧化剂的药物也可以影响机体的功能。抗氧化研究领域的开创者B. Halliwell对抗氧剂的定义进行了明确描述：，能够在与可被氧化的底物相比拟低的浓度水平存在的情况下显著延迟或阻止这种底物的氧化的任何物质均是抗氧剂(Halliwell, 1995)。就这个定义而言，抗氧剂对于那些想保存物质的人很

5、有意义：这些人包括放射药剂师、食品科学工作者、博物馆馆长等。人体也需要很好地进行保护。维生素C、维生素E及谷胱甘肽能够保护组织防止氧化性损伤。当然，机体组织中含有天然的保护剂的概念已为人所熟知。机体中发生的多种氧化过程受到特定抗氧剂的精细调控。在某种情况下，氧化及抗氧化的平衡将被打破，并倾向氧化过程。这种情况就导致氧化应激并最终可能会引起病理变化。抗氧化剂药理学是研究对氧化过程进行干预治疗可能性的学科(Bast, 1994)。 具体而言，实施途径包括两方面图1.。第一条途径集中在现有的药物或有潜在价值的药物上。通过抗氧化活性试验对化合物的进行筛选并评价其抗氧化作用对治疗效果的奉献。第二条途径集

6、中在病理学方面。对病理过程进行研究，内容涉及病理损伤及有关的氧化应激反响。在目前现有的药物中，治疗作用与抗氧化活性有关的一个例子是硫辛酸(Bast et al., 1988)。将两种途径结合起来发挥有效的治疗作用是最为理想的情况。在本综述中，我们主要讨论第一条途径：内容涉及硫辛酸的抗氧化活性方面的研究。图1. 抗氧化剂药理学研究对氧化过程进行治疗干预的可能性硫辛酸硫辛酸(化学名： 1,2-二硫戊环-3-戊酸，图2)存在于所有真核和原核细胞中。硫辛酸是几种2-酮酸脱氢酶的组份，参与能量代谢。硫辛酸通过与2-酮酸脱氢酶多酶复合物的酪氨酸残基连接作为酶的辅酶(Fujiwara et al., 199

7、5; Morris et al., 1995)。硫辛酸与酰基基团结合，并将他们从一个酶复合物转移给另一个复合物。在此过程中，硫辛酸被复原成二氢硫辛酸DHLA，后者随后被硫辛酰胺脱氢酶(Lip- DH)再次氧化用以合成NADH。总之，硫辛酸和DHLA作为对氧化复原对，负责将脱氢酶的底物来源的电子传递给NAD+。图 2. 二氢硫辛酸、硫辛酸及-硫辛酸的化学结构式。结构中包含一个手性中心 (*).R-构型是天然存在的构型。1966年，德国生理学家开始给肝硬化、毒蕈中毒、重金属中毒及糖尿病多发神经病变的病人使用硫辛酸。最初的使用依据来源于肝硬化、糖尿病及糖尿病多发神经病变的病人体内的硫辛酸水平下降的临

8、床观察结果。研究者认为补充硫辛酸能够有助于逆转缺乏状况，并能继而修复2-酮酸氧化反响。事实上，硫辛酸辅酶的功能损伤也可能在病理发生过程中发挥重要作用。在砷中毒情况下，As 3+在2-酮酸脱氢酶的作用下能与硫辛酸生成一种复合物从而被灭活。在某些肝病病人的血清中能检测到识别多酶复合物中的硫辛酸化亚单位的自身抗体(Gut et al., 1995; Tuaillon et al., 1992)。此外，脱氢酶复合物附近发生的氧化应激能够导致氧化性功能损伤(Gutierrez Correa and Stoppani, 1996)，从而对硫辛酸作为辅酶的功能造成不利影响。由于体内硫辛酸与蛋白质结合，因而在

9、人体中未能检测到游离的硫辛酸(Hermann et al., 1996)。 但是治疗给药后就能在循环系统中检测到游离的硫辛酸(Teichert and PreiB, 1995)。药物的治疗作用很可能是由游离的、未结合的硫辛酸产生的。在重金属中毒的情况下，游离硫辛酸及其代谢产物能够捕获循环系统的重金属，从而阻断其损伤作用，并在某种情况下促进其排泄。在糖尿病多发神经病变病人中，游离的硫辛酸可以进入神经组织中，阻断葡萄糖相关的氧化损伤作用。 尤其对糖尿病多发神经病变而言，通过病理学及药物相关的途径，抗氧化剂药理完全有可能成为新的治疗方法。研究结果已经证实氧化应激是糖尿病病理过程的一个组成局部。氧化应

10、激可能是非胰岛素依赖性糖尿病发病中的一个因素(Salonen et al., 1995)。 Wolff et al. (1991) 的结果说明高糖能够引起氧化应激。在链脲菌素大鼠糖尿病模型上，使用抗氧化剂及硫辛酸能够延迟多发性神经病的发生(Cameron et al., 1993; Nagamatsu et al., 1995; Vertommen et al., 1994)。临床试验结果显示3周短期硫辛酸给药不能改善病人的多发性神经病病症。硫辛酸能够减轻病人的神经病主诉，如疼痛及感觉异常(Ziegler et al., 1995)。尽管氧化应激在人类糖尿病发病中的作用尚在研究之中途径2，已有

11、的研究结果为进一步探讨硫辛酸抗氧化活性在氧化应激的作用奠定了坚实根底途径1。氧化应激机体行使功能的根底是有充足的能量供给。需氧生物体通过葡萄糖和脂肪酸等燃料分子的氧化作用产生能量。在氧化反响过程中，来自燃料分子的电子随后被传递给其它分子，直至到达最终的电子受体：O2。氧化应激通常发生在O2复原调控紊乱的情况下。如前所述，氧化应激过程中的一个重要分子是O2 (Halliwell and Gutteridge, 1989)。在基态，O2有两个未成对电子，分布在*反键分子轨道上图3。单线态是氧的更为活泼的状态：1gO2 和1g+O2，能量分别比基态O2高22.4 和 37.5 kcal。O2增加一个

12、单电子时，该电子进入其中一个*反键分子轨道上。这种产物就是超氧自由基O2 -，该分子上只有一个为成对电子。如果再增加一个电子将会产生一个非自由基分子：过氧离子O22-。该分子在质子存在的情况下会生成H2O2。由于O2 -和O22-有额外电子进入到反键轨道，因而氧-氧键能就会下降。O22-增加两个以上的电子时由于电子进入*2p轨道将氧-氧键将完全被破环，从而产生2O2-自由基。总而言之，在生理情况下，O2的两电子复原产物为H2O2，四电子复原产物为H2O。 某些过渡金属可离子能参与O2的复原反响链。氧化型金属离子，如Fe3+和Cu2+, 能促进电子从一种氧自由基传递给另一种自由基。例如，在Fe3

13、+存在的情况下能加速O2的歧化反响：Fe 3+ + O2 - Fe 3+ + O2 (1)Fe 2+ + O2 - + 2H + Fe 3+ + H2O2 (2)2 O2 - + 2H + O2 + H2O2 (3)复原型金属离子，如Fe2+和Cu+，能够提供一个电子因而启动整个反响过程。其中一个例子是Fenton 反响，反响产物是非常活泼的羟自由基(OH) ：Fe2+ + H2O2 中间复合物Fe 3+ + OH + OH - (4)非常微量的Fe 3+即能进一步与H2O2发生反响，尽管该反响在正常生理pH情况下的速度很低： Fe3+ + H2O2 中间复合物 Fe2+ + O2 - +2H

14、+ (5)其它可能的反响还包括： OH + H2O2 H2O + H + + O2 - (6)O2 - + Fe3+ Fe2+ + O2 (7) OH + Fe2+ Fe3+ + OH - (8)这些反响的总和为铁离子催化的过氧化氢的分解：2H2O2 O2 + 2H2O (9)在需氧生物体内，几乎所有的O2复原步骤都是由金属离子催化完成的。金属离子的反响性的调控主要是通过与金属离子与某种酶结合。这些酶包括超氧歧化酶SOD、过氧化氢酶及细胞色素酶。从蛋白环境中解离出来后，金属离子参与其它非机体需要的继发反响如Haber-Weiss反响。SOD的蛋白环境阻断金属催化的O2 - 和H2O2之间的反响

15、，但是非结合的铁和铜离子却能诱导羟基自由基的产生：Fe3+ + O2 - Fe 2+ + O2 (10)Fe2+ + H2O2 OH + OH - + Fe 3+ (11)O2 - + H2O2 OH + O2 + OH - (12)在无铁离子存在的情况下，Haber-Weiss反响的速度几乎为零。该结果说明铁和铜在例子在 OH生成中的具有重要作用。 H2O2和OH以及其它氧来源的自由基，如1gO2和HOCl ，能够损伤DNA、蛋白质脂质分子。人们通常称它们为活性氧自由基ROS。许多ROS都是来源于 O2 -。O2 -是氧毒性作用的主要因子，这就是已被人所熟知的关于氧毒性作用的超氧化物理论。在

16、体内，超氧阴离子的可以通过多种途径生成。首先，某些重要的生物大分子及外源物能在O2 存在的情况下被氧化生成O2 -：这些分子包括甘油醛、复原型核黄素、血红蛋白、肾上腺素、四氢蝶啶、硫醇、百草枯及阿霉素。其次，线粒体电子传递链及内质网也能泄露电子给O2。 在线粒体中，细胞色素氧化酶、NADH-辅酶 Q 复原酶及复原型辅酶Q本身都是电子泄露的部位。在内质网中，细胞色素P-450 酶不正确的反响也能将电子泄露给O2。O2 -的第三个来源是吞噬细胞。这些细胞含有膜结合性酶如NADPH氧化酶，该酶能够按照下面的化学反响式催化合成O2 - 。NADPH + 2O2 2O2 - + H + + NADP +

17、 (13) ROS的毒性作用通常是吞噬细胞杀灭微生物的效应机制。尽管所有的ROS均来自O2复原反响，但是并非所有的ROS都来源于O2 - 。例如NO 是由NO合酶在类似P-450 反响的氧化过程中生成的(Boucher et al., 1992)。在此过程中，复原型氧被整合到NOH-L-精氨酸中间体中 (Nathan, 1992)。当带有单个或多个未成对电子的化合物为小分子且能自由扩散时，人们称之为“自由基。从这一点而言，ROS-如O2、O2 - 、 OH 及轨道上带有未成对电子的金属离子都被认为是自由基。除了某些反响外，大局部的化学反响都可以被认为是极性或自由基反响。在极性反响中，富电子反响

18、物提供一对电子给贫电子反响物形成化学键。相反，在自由基反响中，各反响物仅提供一个电子以形成新化学键。生物学家多年来一直认为生物体中不存在自由基。但是在生物体内观察到的自由基反响结果已经开启了一个新的研究方向：“自由基研究。尽管这个术语从历史根底上讲符合逻辑，但是从化学方面讲还难以讲通。研究者认为该术语适用于研究“自由基，例如“自由阴离子。目前科学家已经认识到这种术语的奇怪性，并着手深入了解整个氧化反响链，而忽略不管它们是否具有自由基特性还是或具有极性性质。图 3. 二价氧分子的分子轨道能势抗氧化剂为了控制体内的氧化过程，生物体配置了多种抗氧化机制。抗氧化酶如SOD、过氧化氢酶及过氧化物酶都与O

19、2 -和H2O2的去除有关。可以通过“没收金属离子以抑制失控的O2 - 的歧化反响、Fenton 反响和Haber-Weiss反响。ROS可以在水相环境中能被小分子化合物如维生素C、谷胱甘肽及尿酸去除掉。在脂质环境中，维生素E可以去除自由基保护胞膜结构。当抗氧化系统功能下降时，内源性大分子的损伤仍有可能被修复，原因在于机体内还含有DNA修复系统、蛋白质转换机制及肽甲硫氨酸亚砜复原酶(PMSR)。如前所述，药物也具有抗氧化活性。总体而言，药物的抗氧化能力取决于它们的化学和物理性质。综合性质及浓度决定了它们的最终的抗氧化活性。为了产生抗氧化效果，药物及其相关的代谢产物必须能够进入到易发生氧化应激的

20、组织中。在抗氧化剂药理学中，研究内容涉及药物的吸收、分布、代谢及排泄。此外，也研究药物及其代谢产物的抗氧化性质。为了评价硫辛酸的抗氧化性质，进行了以下四个方面的研究：1. 金属螯合能力；2. ROS去除能力；3. 再生内源性抗氧化剂的能力；4. 在损伤修复系统中的作用。以上四种性质可以按照纯粹的化学反响进行研究。通过评价它们对抗氧化损伤作用来评价其相应的抗氧化活性。抗氧化活性评价包括体内和体外试验。有关硫辛酸的生物利用度、代谢及抗氧化活性评价的试验内容将在下面章节进行综述。图 4. 健康志愿者禁食一晚口服1g R-硫辛酸后的硫辛酸空心圆、3-酮硫辛酸实心圆及bisnorlipoic acid三

21、角形的血浆浓度-时间曲线。口服R-硫辛酸85 分钟后进食高脂食品。使用装有电化学检测器的高效液相色谱检测各化合物的浓度。硫辛酸的生物利用度我们每日的饮食中都含有硫辛酸，尤其是来源于那些具有高代谢活性的组织的食物中存在着大量的硫辛酸 (Herbert and Guest, 1975; Mattulat and Baltes, 1992)。肉类食品如代谢性器官-猪心中的硫辛酸含量为1.1-1.6 mg/kg，而腓肠肌中的硫辛酸含量仅为0.07-0.15 mg/kg (Mattulat and Bakes, 1992)。该结果显示饮食中的大局部硫辛酸来自于多酶复合物。蛋白水解酶不能有效剪切硫辛酸和赖

22、氨酸之间的肽键。因而，研究者认为食物消化后，硫辛酸是以硫辛酰赖氨酸形式被机体吸收的(Martulat, 1992)。此外，机体可以利用脂肪酸和半胱氨酸从头合成硫辛酸(Carreau, 1979; Spoto et al., 1982)。 研究结果显示硫辛酸的合成为蛋白质结合方式 (Spoto et al., 1982)。从食物摄取或生物合成的硫辛酸中，只有极少局部以游离形式进入循环系统。口服给药后，游离硫辛酸的量相对较大。治疗药物剂量远远超过从饮食中的摄取量。大鼠静脉注射使用剂量高达10 mg/kg，而人体的静脉注射剂量高达1200 mg，折算起来约相当于1000 kg猪心中的硫辛酸含量。给药

23、后，可以在血浆(Teichert and PreiB, 1995)和组织(Maitra et al., 1996)中检测到硫辛酸。最初有关硫辛酸的检测方法都包括一个水解步骤，以便将硫辛酸从酪氨酸残基上解离下来。由于人们认为游离态的硫辛酸是发挥治疗作用最重要的形式，目前的研究都对游离硫辛酸的含量进行了分析(Biewenga et al., 1996c; Handelman et al., 1994; Hermann et al., 1996)。 图4中的结果显示，健康男性志愿者口服1 g R-硫辛酸后血浆中游离硫辛酸的含量高达1,154 ng/ml。Hermann等 (1996) 广泛研究了硫辛

24、酸消旋体的不同剂型的药代动力学及生物利用度。结果显示，硫辛酸的血浆半衰期约为30 min图4也可以得到同样结果。硫辛酸的平均总血浆去除率与肝脏血流量在相同的范围内(约为 11-17 ml/ min kg)。由此可以推测肝脏是硫辛酸主要去除器官。硫辛酸的绝对生物利用度(Fabs) 计算值在20% 和38%之间，与异构体和剂型有关。 目前还不清楚药物的生物利用度和抗氧化活性介导的药理作用之间的关系。但是致死剂量和生物利用度之间似乎存在某种关系。生物利用度的结果为口服和其它给药途径之间的LD50值的差异提供了解释 (表 1)。 基于这些数据进行外推，人体可以耐受克级剂量的硫辛酸。实际上，目前尚无人体

25、使用1g 硫辛酸后出现严重副反响的报道。给86个糖尿病病人静脉注射1200 mg硫辛酸后，28人出现恶性或呕吐不良反响(Ziegler et al., 1995)。 肌肉注射40 mg药物后，有病例报道注射部位发生灼痛 (von Schreiber, 1961 )。表 1. 硫辛酸动物半数致死剂量给药途径 大鼠LDs0 小鼠LD50 p.o. 1,130 mg/kg 502 mg/kg i.p. 200 mg/kg 160 mg/kg s.c. 230 mg/kg 200 mg/kg i.v. 180 mg/kg 210 mg/kg 摘自Lewis 和Sweet的研究报告， 1985。图 5.

26、 LipDH 催化从外消旋硫辛酸方块和R-硫辛酸圆圈合成DHLA的初始速率。为了进行比照，将使用外消旋硫辛酸得到的速率乘以2。在前60 s, 使用巯基试剂二硫双硝基苯甲酸DTNB在1.0 mM NADH存在的情况下，在500nm波长处检测生成的DHLA。参加LipDH (5 g/ml)启动反响。硫辛酸的体内代谢复原反响 硫辛酸能被复原成二巯基化合物DHLA图2.。由于该复原型硫辛酸是硫辛酸在体内发挥抗氧化活性的重要形式，人们对这种复原反响的机制进行了研究。二硫化物可以被其他巯基化合物复原。在正常情况下，体内巯基化合物谷胱甘肽复原型，GSH的含量很高。从原理上说GSH能够复原硫辛酸分子内的二硫键

27、。但是，该反响的速率极低以至于从未观察到GSH对硫辛酸大量的复原反响发生(Biewenga et al., 1996b)。硫辛酸的复原更重要的是依靠酶促反响。在线粒体中， LipDH 也能催化2-酮酸脱氢酶的逆反响。它能通过消耗NADH催化游离硫辛酸的复原反响。在胞浆中，GSH 复原酶通过消耗NADPH催化复原反响的进行。值得注意的是，两种酶具有相反的立体特异性。哺乳动物的GSH复原酶催化S-型硫辛酸的速度为R-型硫辛酸的两倍(Pick et al., 1995)。哺乳动物的LipDH 复原R-硫辛酸对映体的速度约为S-型对映体的28倍 (Biewenga et al., 1996a; L6f

28、felhardt et al., 1995)。用于临床治疗的硫辛酸是一种外消旋混合物。最初人们认为S-硫辛酸是LipDH的弱性底物，有可能占据其活性位点，从而抑制R-硫辛酸的复原反响。研究结果说明S-硫辛酸确实能够抑制LipDH的酶活性(Biewenga et al., 1996a; L6ffelhardt et al., 1995)。但是，当在饱和浓度的NADH存在的情况下(高于0.1 mM)，使用外消旋混合物时并未观察到DHLA合成减少图5。显然， R-DHLA 的合成并不受到S-硫辛酸的影响。因此，应当将S-硫辛酸看作是外消旋硫辛酸LipDH 依赖性复原反响的立体异构扩展底物。但是，外消

29、旋硫辛酸复原反响的立体特异性没有预先想得那样严格。DHLA是一种强效复原剂，它能复原二硫基，也能复原硫辛酸分子内的二硫键。使用外消旋硫辛酸后，R-DHLA 和S硫辛酸将在同一细胞空间内共存，将会发生一种异构体被其它复原型异构体以非酶促反响形式复原。除了GSH复原酶催化的复原反响，S-DHLA还可以以非酶催化方式复原R-硫辛酸。该结果说明不能将难复原性R-硫辛酸认为是立体异构最正确底物。总体而言，从理论上讲，复原外消旋混合物的效果要优于分别复原两种异构体的效果。由于在体内DHLA高度活泼而无法进行检测。例如在人血浆中，DHLA进入机体后快速与血浆组份发生反响(Biewenga et al., 1

30、996c; Teichert and Preil, 1995)。但是使用人红细胞和大鼠晶状体证实了DHLA在体内的合成(Constantinescu et al, 1995)。给新生大鼠使用硫辛酸时，外消旋形式的硫辛酸比R-或S-型硫辛酸产生更多的DHLA。与该结果相符的是，外消旋硫辛酸对丁胱亚磺酰亚胺BSO诱导的白内障的保护作用强于两种纯异构体(Maitra et al., 1996)。图 6. 已经得到鉴定的硫辛酸主要代谢产物的化学结构-氧化反响硫辛酸的其它一种代谢反响为戊酸侧链的-氧化反响图6。在恶臭假单胞菌LP菌株中， bisnorlipoic acid、tetranorlipoic

31、acid 及-hydroxybisnorlipoic acid 是-氧化反响的主要代谢产物(Furr et al., 1978)。在大鼠尿液中，除上述3种代谢产物外，还检测到一种酮类产物(Spence and McCormick, 1976)。此外，CO2也是-氧化反响的一种代谢产物，通过分解三羧酸循环中的乙酰CoA而产生图6。实际上，给大鼠使用1,6-14C硫辛酸后， 呼出气体中含有14CO2 (Harrison and McCormick, 1974)。Harrison 和 McCormick的研究进一步为-氧化反响提供了支持(1974)。将14C硫辛酸与线粒体制备物孵育后产生14CO2，

32、使用未标记的脂肪酸时能够降低14CO2的产生。 硫辛酸在人体中的代谢研究是最近才开展的。研究发现人体同样存在-氧化作用。在人血浆中能够检测到bisnorlipoic acid (图4)。男性志愿者口服1g R-硫辛酸后，bisnorlipoic acid的最高浓度704 ng/ml出现在给药189 min后(Biewenga et al., 1996c)。尿液中的主要代谢物为S4,S 6-dimethylbisnorlipoic acid (Locher et al., 1995)，结果说明-氧化作用产物在经尿液排泄前还被进一步代谢。总之，DHLA、bisnorlipoic acid、 -hy

33、droxybisnorlipoic acid及tetranorlipoic acid在体内都有可能在硫辛酸的抗氧化效应中发挥作用。研究者已经开展很多关于DHLA的抗氧化特性方面的研究。这局部将在下面章节中进行综述。但是bisnorlipoic acid和tetranorlipoic acid方面的抗氧化作用的研究开展较少，其它代谢物方面那么尚无相关研究报道。金属螯合作用化学反响具有金属螯合特性的化合物可以产生抗氧化作用，但也可能会充当促氧化剂角色。当在形成金属被屏蔽的复合物中所有的O2 配位点都被占据时，就能产生抗氧化活性。此外，当电子密度从金属离子回撤到螯合剂时因电子不能被转移给O2 时也能

34、产生抗氧化活性。当存在空闲O2 配位点和金属离子被复原时却能产生促氧化作用。配体将电子转移给金属离子，随后被转移给O2。进行Fe2+或Fe3+络合的研究收获甚微，因为在这种条件下容易产生不溶性的氢氧化铁。因而，在水溶液中进行的铁络合作用的研究主要是通过取代的铁螯合剂进行的。研究结果说明，在极性非水溶液中，硫辛酸能够与Mn 2+, Cu 2+, Zn 2+, Cd2+和Pb2+形成复合物 (Sigel,1982; Sigel and Prijs, 1978)。此外，硫辛酸不能螯合Fe 3+ (Cornaro et al., 1985)。DHLA能够螯合Co2+、N2+、Cu2+、Zn2+、Pb2

35、+ (Sigel, 1982)， Hg2+ (Brown and Edwards, 1970) 及Fe3+ (Comaro et al., 1985; Kawabata et al., 1995)，所形成的复合物在水中的溶解度很低。研究结果还说明DHLA与Fe3+ 形成的复合物比与Fe2+形成的复合物更稳定 (Bonomi et al., 1985)。硫辛酸代谢物tetranorlipoic acid及bisnorlipoic acid 能与Cu2+、Zn2+、Cd2+ 和 Pb2+形成复合物 (Sigel, 1982)。体外及体内金属螯合作用硫辛酸可能通过螯合铁而产生抗氧化作用。该结论是建立

36、在OH去除分析的分析结果之上(Scott et al., 1994)。在该研究中，使用脱氧核糖作为指示分子。脱氧核糖与铁结合后诱导位点特异性的脱氧核糖降解。但是参加硫辛酸后，硫辛酸能够将脱氧核糖从脱氧核糖-铁复合物中取代下来。以前的研究结果显示硫辛酸不能螯合Fe 3+ (Cornaro et al., 1985)。因此可以推论硫辛酸通过螯合Fe 2+ 从而降低可被脱氧核糖检测到的 OH的水平。一项脂质过氧化研究也得到其金属螯合作用方面的证据。在该研究中，通过将Fe2+或Fe3+与维生素C孵育诱导氧化应激。维生素C螯合铁离子，并将其复原成Fe2+。随后Fe2+能将一个电子转移给氧或其它ROS从而

37、诱导氧化应激。在等摩尔铁离子和维生素C存在的情况下，硫辛酸能够与维生素C竞争铁螯合作用，从而阻止脂质过氧化(Scott et al., 1994)。 但是当维生素C相对于铁过量50倍时，硫辛酸无法与维生素C竞争螯合铁离子作用，也就不能阻止脂质过氧化图7(Bast and Haenen, 1988)。同样，硫辛酸可以络合Cu 2+，这一结果可以解释硫辛酸对Cu 2+诱导的脂质过氧化产生保护作用的原因 (Ou et al., 1995)。图 7. 脂质过氧化的时间过程曲线。通过检测 HYPERLINK javascript:showjdsw(showjd_0,j_0) 硫代巴比妥酸(TBA) 反响

38、物的水平来评价脂质过氧化水平。 与TBA反响后，在535 nm波长测定生成产物的吸光度值600 nm用于校正蛋白沉淀。将大鼠肝微粒体与0.2 mM 维生素C和下面各组试剂孵育：(1) 不添加， (2) 0.5 mM DHLA，(3) 1 mM GSH，(4) 0.5 mM DHLA加上1 mM GSH，(5) 0.5 mM DHLA加上0.5 mM 氧化型谷胱甘肽 (GSSG)。单独使用0.5 mM GSSG 或 0.5 mM 硫辛酸无作用，结果与反响1相同。The effect of 0.5 mM硫辛酸加上1 mM GSH与单独使用1 mM GSH的反响 (3)的结果无差异。为了确保清晰性未

39、将后面的结果在图中显示。参加10 M Fe2+到所有反响中以启动反响。 DHLA对金属离子的络合作用也能够产生抗氧化作用。Cd 2+诱导的脂质过氧化的试验结果证实了这一点(Mtiller and Menzel, 1990)。但是，DHLA对于其它过渡金属来说是一种有效的复原剂，从而会引起促氧化作用。例如，DHLA很容易将 Fe3+复原成 Fe2+。该复原反响引起Fe2+升高，进而会促进Fe2+/维生素C诱导的脂质过氧化(Bast and Haenen, 1988; Scott et al., 1994) 。与对照组相比，TBARS 终浓度较高，也确证了其促氧化活性见图7。当然，这种促氧化活性可

40、能是Fe3+复原和维生素C共同作用的结果详述见后。总体而言，DHLA会与其它金属螯合分子发生竞争。体外研究结果显示，过量的DHLA能够与铁蛋白发生竞争，从而铁离子从铁蛋白上释放出来(Bonomi and Pagani, 1986)，但是尚不知道这种情况在体内会不会发生。化合物能否加速Fe3+/博来霉素诱导的DNA降解常被用来评价其复原铁离子产生的促氧化活性。然而，DHLA并不促进Fe3+/博来霉素诱导的DNA降解(Scott et al., 1994)，说明DHLA并不能将替代复合物中的博来霉素。在大鼠上观察了硫辛酸通过金属螯合活性发挥抗氧化活性。硫辛酸能够阻断Cd2+诱导的脂质过氧化对脑、心

41、脏及睾丸的损伤作用(Sumathi et al., 1994)。ROS去除能力化学反响调节氧化应激的一种方法是使用ROS去除剂。当ROS和去除剂之间的反响速度高于ROS和其靶分子反响的速度时就能到达抗氧化效果图8。在机体中，许多存在于组织及细胞内外液中的生物大分子都可能成为ROS损伤的目标。和所有的化学反响一样，自由基去除反响的速率由去除剂的浓度及速率常数决定图8中的k3。设计的评价化合物对ROS去除能力的试管实验能够得到速度常数方面的信息。两种方法被用于评价化合物的ROS去除能力：竞争试验及监测反响物浓度的时间过程试验。为了对不同方法进行说明，在此对次氯酸去除试验的原理加以详述。与ROS去除

42、分析的原理相似，可以将体内试验设计成图8中所示的竞争分析。在此方法中，去除剂与指示分子竞争ROS。在无去除剂存在的情况下，指示分子产生可被检测的信号。通过检测受试化合物对指示分子产生的信号的抑制程度来评价化合物的自由基去除能力。在许多去除评价方法中，所研究的ROS是不稳定的物质，必需在试管中产生。HOCl 可以由绿过氧化物酶/H2O2/C1系统产生。但是，HOCl 相对较为稳定并且有商品化的产品可供使用。因而可以将该方法进行简化，使用HOCl 替代HOCl 发生器(Winterbourn, 1985)。通过将HOCl 参加到去除剂和指示分子混合物中启动试验图8。需要指出的是，去除剂和指示分子的

43、浓度是按照指示分子的含量能够容易被分析仪器检测到的方式进行选择的。其浓度未必在生理范围内。由于HOCl 和与之相适应的指示分子之间的反响的速率常数尚属未知，因而也无法计算去除反响的速率常数k3，图8。 因此，给出的化合物的HOCl 去除能力评价结果只是等级得分。图 8. ROS 去除的要素物质。在体内内源性生物分子替代了指示分子。最近，Folkes et al. (1995)为了得到速率常数采用了第二种方法即监测反响物浓度的时间过程。他们通过省略指示分子简化了HOCl去除试验。因而，他们的试验设计仅涉及HOCl的去除反响。通过测定下面的反响物中的其中一个进行反响速率的计算：HOCl、 去除剂或

44、被氧化的去除剂。然而，某些高效的去除剂如GSH与HOC1反响速度很快而无法测定他们的速率常数。但是该方法的原理已经成功被用于其它ROS的研究表2和表3。研究者已经开展了多种HOCl去除方面的试验，目的是对DHLA、硫辛酸、bisnorlipoic acid及tetranorlipoic acid的自由基去除能力进行评价。弹性蛋白酶分析的结果显示所有以上的化合物均是很好的去除剂 (Biewenga et al.,1994; Haenen and Bast, 1991; Scott et al., 1994)。在该分析方法中，指示分子是1-抗蛋白酶(1-AP)。与HOCl 反响后，通过测定混合物的

45、剩余弹性蛋白酶对混合物的抑制能力来检测剩余的1-AP (图 9)。在TNB分析中，巯基化合物5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)为指示分子(Ching et al., 1994)。该研究只对硫辛酸进行了评价，它比其它去除剂如S-甲基谷胱甘肽GSMe更为有效保护TNB。 未对DHLA进行评价的原因是因为它能与被氧化的TNB发生反响而对实验结果产生干扰。 在蛋白羰基分析中，牛血清白蛋白BSA被HOCl 氧化后产生蛋白羰基，该基团可以使用2,4-二硝基苯肼进行检测。DHLA在所有受试品中是最有效的自由基去除剂。值得注意的是，硫辛酸在阻止蛋白羰基形成方面的作用要弱于GSMe。化合物在TNB和羰基分析中观

46、察到的对HOC1去除活性的等级差异可能是因干扰反响造成的。巯基和胺类化合物会干扰蛋白质羰基的形成或它们会与羰基发生反响(ONeill et al., 1994)。总体上讲，受试化合物对信号形成产生干扰是竞争分析方法一个缺陷。总而言之，研究者设计了HOC1去除评价方法以得到反响的相关信息，即HOC1和去除剂之间的反响。在这方面提出三点需要明确之处。首先，应当强调的是ROS去除作用其实就是速度问题。这点可以从-硫辛酸的结果可以看出。尽管-硫辛酸在弹性蛋白酶分析中能与HOC1发生反响，但是反响速度不够快而缺乏以与1-AP竞争(Biewenga et al., 1994)。其次， 在体内HOC1去除反

47、响从来不是单一反响，而是伴随着一系列反响。TNB和羰基分析中观察结果的差异可能是由于这些反响造成的。由此引出第三点，抗氧化活性只是一个相对概念。硫辛酸可以保护TNB，而对BSA却无保护作用。因而严格来说，当认为某个化合物具有抗氧化活性时，必需考虑其作用的靶分子。 硫辛酸及其代谢产物也能去除其它ROS。有关硫辛酸和DHLA的ROS去除能力进行概述的内容见表2和表3。如想获得有关这些分析方法及结果的详细内容，读者可以参考其它文献资料(Halliwell, 1995; Packer et al., 1995; Scott et al., 1994)。ROS体外去除作用氧化应激不是由单个反响引起的，而

48、是一系列自由基和非自由基反响引起的。氧化应激的最终结果会造成蛋白质、DNA或脂质损伤。研究者开展了多种方法来研究不同的氧化过程。在这其中，研究最深入的是脂质过氧化过程(Halliwell and Gutteridge, 1989)。该氧化过程可以被进一步细分为个事件图10：启动反响，脂质非过氧化氢依赖性反响和脂质过氧化氢依赖性反响，及终末反响。启动反响为脂质膜中的多不饱和脂肪酸上的夺氢反响：继而，通过链式反响产生越来越多的脂质来源的自由基。当两个自由基形成一个稳定的非自由基产物时链式反响才能最终停止。在脂质过氧化过程中，能够从以下两种机制去除ROS的化合物具有抗氧化活性。首先，能去除启动氧化过

49、程的ROS的化合物。ROS去除的化学反响机制已经在前面章节中提及。其次，能阻断链式反响的抗氧化剂的化合物。例如维生素E是一种内源性链式反响阻断抗氧化剂。它与中间自由基过氧及烷氧自由基，见图10的反响速度要高于与能从周围脂质夺氢的自由基反响的速度。 硫辛酸和DHLA对微粒体脂质过氧化的作用的结果见图7。通过使用Fe2+-维生素C混合物产生ROS以启动实验。 在该分析中，如果药物有抗氧化作用，将会在ROS产生和脂质过氧化反响开始之间产生一个滞后时间。然而，结果显示硫辛酸和均未产生滞后时间，说明在该分析中，两者均未显示出抗氧化活性。基于这个结果可以得出结论：两种化合物均不能去除Fe2+/维生素C产生

50、的作为启动因子的ROS。此外，结果还说明硫辛酸和DHLA都不是链式反响阻断抗氧化剂。 表2 硫辛酸对ROS的去除氧化剂效应发生系统指示分子检测反响物去除能力参考文献O2-黄嘌呤氧化酶DMPO自旋阱(Suzuki et al., 1991)-次黄嘌呤氧化酶细胞色素C(Scott et al., 1994)H2O2-过氧化物酶(Scott et al., 1994)OH+H2O2 / Fe2+DMPO自旋阱DHLA=LA(Suzuki et al., 1991)+H2O2 / Fe2+氨基苯二酰肼(Suzuki et al., 1991)+H2O2/Fe2+/抗坏血酸脱氧核糖k=4.711010/

51、M/sec(Scott et al., 1994)+NP-发光DMPOk=1.921010/M/sec(Matsugo et al., 1995)+NP-发光BSA(Matsugo et al., 1995)+NP-发光水杨酸(Matsugo et al., 1995)+NP-发光Apo-B-蛋白(Matsugo et al., 1995)HOCl+1-APDHLA, GSH, LA GSMe GSSG, cystine(Haenen and Bast, 1991) (Biewenga et al., 1994)+TNPLA GSMe GSSG(Ching et al., 1994)+BSAD

52、HLA GSH GSMe LA cystine, GSSG(Yan eta/., 1996)CCl3O2+CCl4辐射分析CCl3O2k=1.8108/M/sec(Scott et a/., 1994)1gO2+红烯自氧化红烯k=1108/M/secbenzene(Stevens et al., 1974)+NDPO2热分解1gO2k=1.3108/M/sec(Kaiser et al., 1989)ONOO-+酪氨酸DHLA, GSH LA GSSG(Whiteman et al., 1996)+1-APDHLA, LA, Met GSH GSSG(Whiteman et al., 1996

53、)ABAP-ABAP热分解B-藻红蛋白(Kagan et al., 1992)缩略词： a1-AP, a-l-抗蛋白酶；ABAP, 2,2-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride；BSA，牛血清白蛋白；DHLA, 二氢硫辛酸；DMPO, 5,5 -dimethyl- 1-pyrroline-N-oxide；GSMe，S-甲基谷胱甘肽；LA，硫辛酸；NDPO2， 3,3-( 1,4-naphthylide )dipropionate的内过氧化物; NP-III, N,N-bis(2-hydroperoxy-2-methoxyethyl)-l,4,5,8-n

54、aphthalene-tetracarboxylic diimide); TNB, 5-thio-2-nitrobenzoic acid.表 3 DHLA对ROS的去除氧化剂效应发生系统指示分子检测反响物去除能力参考文献O2-+黄嘌呤氧化酶DMPO自旋阱k=3.3105/M/sec(Suzukiet al., 1991)+黄嘌呤氧化酶肾上腺素k=7.3105/M/sec(Suzuki et al., 1993)-次黄嘌呤氧化酶NBT(Scott et al., 1994)+细胞色素P450/阿霉素DMPO自旋阱k=4.8105/M/sec(Dikalov et al., 1996)+细胞色素P

55、450/阿霉素DHLAk=4.8105/M/sec(Dikalov et al., 1996)H2O2-H2O2(Haenen et al., 1990)-DHLA(Scott et al., 1994)OH+H2O2/Fe2+DMPO自旋阱DHLA=LA(Suzuki et al., 1991)-H2O2/Fe3+/维生素C脱氧核糖(Scott et al., 1994)HOCl+1-APDHLA,GSH,LAGSMe GSSG, cystine(Haenen and Bast, 1991)(Biewenga et al., 1994)+BSADHLA GSH GSMe LA cystine

56、, GSSG(Yan et al., 1996)CCl3O2+CCl4辐射分解CCl3O2k=2.107/M/sec(Scott et al., 1994)1gO2-NDPO2热分析1gO2(Kaiser et al., 1989)+四甲基对苯醌光解1gO2k=5.7105/M/sec(Bisby et al., 1996)NO+巨噬细胞NO(以NO2-形式)(Burkat et al., 1993)ONOO-+酪氨酸DHLA, GSH LA GSSG(Whiteman et al., 1996)+1-APDHLA, LA, Met GSHGSSG(Whiteman et al., 1996)

57、ABAP+ABAP分解B-藻红蛋白(Kagan et al., 1992)缩略词： a1-AP, a-l-抗蛋白酶；ABAP, 2,2-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride；BSA，牛血清白蛋白；DHLA, 二氢硫辛酸；DMPO, 5,5 -dimethyl- 1-pyrroline-N-oxide；GSMe，S-甲基谷胱甘肽；LA，硫辛酸；NBT，硝基四偶氮蓝；NDPO2， 3,3-( 1,4-naphthylide )dipropionate的内过氧化物; TNB, 5-thio-2-nitrobenzoic acid。图 9. DHLA (三角)

58、, lipoic acid (实心圆)及-硫辛酸 (空心圆)的HOCl去除能力。在参加50 M HOCl之前，将受试化合物与20 g l-AP混合。以其生理功能形式表示指示分子l-AP的剩余量。 通过使用N-t- BOC-L丙氨酸 p-硝基苯酚酯作为底物来测定弹性蛋白酶的抑制百分比。在410 nm波长处检测分解产物的生成速率。 当使用2,2-azobis(2,4-dimethyl-valeronitrile (AMVN)热解法启动脂质过氧化反响时得到不同的结果表4。该分析的结果显示，硫辛酸具有中等强度的抗氧化作用，而DHLA那么是一种很好的抗氧化剂(Kagan et al., 1992)。该结

59、果可以用DHLA能够阻断脂质过氧化反响的启动来解释。DHLA可能能够去除启动脂质过氧化反响的AMVN自由基，因为已有研究显示DHLA能够去除结构与之相似的ABAP自由基表3。 图10. 脂质过氧化反响的顺序。 LH 是一种多不饱和脂肪酸， LOOH 是相应的脂质氢过氧化物。化合物在Fe2+-维生素C和AMVN诱导的脂质过氧化反响中呈现的不同作用效果再次说明术语“抗氧化剂的相对性。除了靶分子种类的重要性外，氧化反响的种类也很关键。大局部体外ROS去除试验中，氧化应激反响均与某种疾病病因相关。这些评价关注的中心是可被氧化的底物如，蛋白质、DNA、脂质、细胞及器官。对于硫辛酸和DHLA，研究者开展R

60、OS去除试验以观察它们的抗氧化活性表4。基于不同氧化应激及不同欲施加保护对象的组织的实验结果进行分析，可以得出如下结论：硫辛酸和DHLA均能在体外通过去除ROS而发挥抗氧化作用。体内ROS去除作用研究者开展了多个实验以评价硫辛酸和DHLA体内抗氧化活性表5。大局部的体内试验都使用假定氧化应激可能参与疾病发生的某种动物模型。例如链脲菌素被用于糖尿病动物模型。链脲菌素能够诱导血糖升高从而引起氧化应激。因此氧化应激或多或少与该疾病过程有关。但是，通过化学诱导也能诱发氧化应激。如1-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP;表5) 及四氧嘧啶图1