害虫是造成农林业减产的重要因素

1、植物抗虫转基因工程1前言随着世界人口的不断增长，持续提高粮食产量显得更为迫切。减少病虫危害的损失是增 加产量的重要途径。采用喷施化学农药和生物杀虫剂等手段防治固然可以减轻害虫对农作物 的危害，但前者会造成环境污染、后者成本较高等。据统计全球粮食总产量每年因虫害造成的 损失达14%，直接给农业生产造成的经济损失达数千亿美元。我国因虫害水稻每年减产10%、 小麦减产20%、棉花减产30%以上1。长期以来，农作物害虫防治依赖于合成化学杀虫剂，尽 管它们全球的销售量每年高达10亿美元，但仍未根本控制害虫的危害，还严重污染了环境、食 物链和水资源。因此，减少杀虫剂使用量，发展现代植物保护技术，已成为可持

2、续发展农业 中必须正视的课题之一2。自然界有少数栽培种或品种具有抗虫性3，在受到害虫侵袭时，寄主植物常会合成一些化 学保护物质，如棉花中的棉酚和油菜中的芥子酸，以阻止害虫的进一步危害；人们在早期如 对一些害虫不加防治，有利于植物在后期形成较强的抗性以抵御危害严重的害虫等囹。植物基 因工程克服了传统育种受基因资源限制的缺陷，它导入的抗性基因不局限于植物，可拓展到 动物、微生物甚至于人工合成的基因，而且允许一次导入多个不同的目的基因，将特定性状 转入目的遗传背景的时间明显缩短。通过常规育种技术和试管培养技术虽然已获得某些抗虫害的作物品种。如野生型马铃薯 (Solanum chacoense )和栽

3、培型马铃薯(S.tuberosum )的原生质体电融合获得的体细胞杂合品 系对一种马铃薯甲虫具有抗性。然而，新品种的选育需要较长的时间，并且某些虫害尚无基因 资源作为杂交的亲本。所以，用这种途径来获得抗虫作物是很困难的。植物抗虫基因工程是现代生物技术研究领域的重要成果，它的诞生为害虫的防治提供了 一条崭新的途径。自1987年首次报道抗虫转基因植物以来，至1995年,抗虫转基因马铃薯进 入商品化生产，次年，抗虫转基因棉花和玉米也进入商品化生产。植物抗虫基因工程的研究 之所以能取得如此迅猛的发展,主要是由于利用基因工程培育抗虫作物新品种或新品系具有以 下几个明显的优点：(1)保护作用具有连续性，可

4、控制植物整个生长期内害虫的危害;(2)对整 个植株都有保护作用，包括化学杀虫剂很难接触的叶下表面及根部等；(3)对害虫毒性具有专 一性;(4)可大大缩短育种周期，降低成本；(5)所表达出的杀虫蛋白存在于植物体内，不易被 气候等环境因素破坏，也不对环境造成污染;(6)基因资源非常丰富。目前全世界最常改良的性 状中抗虫占第二位(24%)5。转基因作物在大田上作大规模释放最早的是中国，即抗烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒双 抗的转基因烟草，转基因烟草1992年在河南就发展到8600 hm2。1998年5月至今，我国农业部 生物工程安全委员会批准了6种作物准许商品化生产的许可证，分别为耐储存西红柿、转查尔

5、酮(CHS)基因矮牵牛、抗黄瓜花叶病毒甜椒、抗黄瓜花叶病毒西红柿、单价抗虫棉花、双价抗 虫棉花等。而抗虫棉是我国目前唯一大面积种植并初步实现产业化的转基因农作物，2002年 种植面积超210hm2，首次超过全国棉花410 hm2的一半(51%)6。2抗虫基因及其研究进展人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因，有许多抗虫转基 因植物正在进行田间试验，并有一些品种已商品化。迄今发现并应用于提高植物抗虫性的基 因主要有两类：一类是从细菌中分离出来的抗虫基因，如苏云金杆菌毒蛋白基因奁七基因)、异 戊基转移酶基因(ipt)，另一类是从植物中分离出来的抗虫基因，如蛋白酶抑制剂基因(P

6、I基因)、 淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。其中BtS因和PI基因在农业上利用最广。2.1来源于微生物、细菌中的抗虫基因2.1.1 Bt杀虫晶体蛋白基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革蓝氏阳性土壤芽孢杆菌，在形成芽孢时， 可产生杀死昆虫幼虫的蛋白质，即通常所说的杀虫品体蛋白(insecticidal crystal protein)或8- 内毒素(8 - endotoxin)，也称苏云金芽孢杆菌毒蛋白(B.t. toxic protein)o它是目前世界上生产量 最大的生物农药杀虫剂，广泛用于防治农业、林业等方面的害虫。Bt杀虫品体蛋白是一类 分子量为

7、130160kD的蛋白质，在昆虫中肠碱性和还原性的环境下，被降解成6575 kD的 活性小肽，并和中肠纹缘膜上的受体结合。现已证明受体为氨肽酶N和钙粘着蛋白(cadherin) 类似物。与受体结合的活性小肽插入到细胞膜上并形成穿孔，使细胞膜周质和中膜腔之间的 离子平衡破坏，引起细胞肿胀甚至裂解，从而导致昆虫瘫痪或死亡9、10。自1901年日本生物学家Iskiwata首次从患猝倒病家蚕中分离出苏云金杆菌(Bacillus thuringiesis, B.t.)以来，目前已发现B t对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅 目、食虫目等昆虫有毒杀作用，还能防治线虫、螨、原生动物和扁形动物；B

8、t具有高特异的 杀虫活性，主要是因为它能产生杀虫品体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)，编码杀虫蛋 白的基因称为品体蛋白质基因，简称cry基因11、12。Crickmore等13在1995年国际无脊椎动物病理学会年会(SIP)上提出了以杀虫品体蛋白 氨基酸序列的同源性为唯一依据区别Bt基因的新分类系统，现已被各国广泛采纳。同源性在 45 %以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45 %78 %之间，为第二等级，用大写 英文字母表示；同源性在78 %95 %之间，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95 % 以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示

9、。只要满足来自Bt的伴孢包涵体(品体)，与已知的cry (只有杀虫活性)或cyt (具有溶血溶细胞作用的27kDa品体蛋白基因)具有高的同源性， 就可以纳入这个系统14。自1981年第一个杀虫品体蛋白基因被克隆和测序以来15，截止到 2004年1月已经发现299种杀虫品体蛋白基因，分属于44群(其中cry基因42群，cyt基因2 群)，136模式基因【16、切。最近几年，又相继发现了兼抗鳞翅目和鞘翅目的Bt毒蛋白(CryV)、抗线虫的Bt毒蛋白 (Cry VI)。大多数苏云尽芽孢杆菌株系可产生几种晶体蛋白(Cry蛋白)，每一种Cry蛋白寄 主范围相当狭窄切。1987年，世界上有4个实验室首次报

10、道获得转Bt杀虫品体蛋白基因的烟草或番茄植株 19-22，此后Bt基因被相继转入到棉花、水稻、玉米、苹果和核桃等作物中。美国用农杆菌介 导法将Bt基因导入壳籽棉，育成世界上首例抗虫棉，棉铃虫为害率下降50%。1996年美国Bt 基因抗虫棉种植面积72万hm2，约占总植棉面积14%。我国是继美国后育成抗虫转基因棉的第 二个国家，育成中国第一代单价抗虫棉的抗虫性在90%以上，减少用药60%80%，增产 30%40%。1992年底中国农科院生物技术研究中心的郭三堆23等人在国内首先人工合成了 Bt基因之后，又对豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpT I)基因进行了修饰，构建了同时带有这两种基因 的双价杀虫基因高

11、效植物表达载体，再通过花粉管通道转化技术导入我国不同棉花生产区的 主栽品种，已获得了数十个双价转基因抗虫棉株系。双价抗虫转基因棉花研制成功并大面积 进入田间试验，目前我国在抗虫棉方面的研究已取得了较大的进展剖。近年来人们在Bt毒蛋白基因的修饰与改造、表达载体的构建、植物组织化、抗虫植物的 培育等方面作了大量工作25。尽管Bt杀虫品体蛋白的杀虫效果非常好，但其杀虫谱较窄，对其敏感的主要是鳞翅目和 鞘翅目的一些害虫，如棉铃虫、玉米螟、马铃薯甲虫等。目前利用上述这些杀虫品体蛋白尚 不能控制许多重要的其它农业害虫的危害，加之绝大部分Bt杀虫品体蛋白基因需经过改造或 重新合成才能提高它们在植物体内的表达

12、量，表现出高抗虫性。因而人们在继续发掘新型的 Bt杀虫品体蛋白基因的同时，也把注意力部分转向其它来源的抗虫基因。2.1.2其他来源于微生物的抗虫基因异戊烯基转移酶(ipt )是细胞分裂素合成中的关键酶，来源于Agrobacterium tumefaciens 的ipt基因在烟草、番茄中表达后，可减少烟草夜蛾对叶片的损伤，并降低桃蚜的生存力。然 而，ipt基因的表达对植物发育有负面影响，如使根系发育不完全，降低叶绿素含量等26。2.2来源于高等植物的抗虫基因2.2.1蛋白酶抑制基因蛋白酶抑制剂(Proteinase Inhibitor，PI)是自然界含量最为丰富的蛋白种类之一，是植物 天然防御系

13、统中的一部分，可抵抗食草动物的侵食。其机理在于它能与昆虫消化道内的蛋白消 化酶相互作用，形成酶抑制剂复合物，阻断或减弱消化酶的蛋白酶水解作用，刺激消化酶的 过量分泌，使昆虫产生厌食反应，导致非正常发育或死亡。1936年Kunitz等27 首先从牛胰脏中分离出碱性胰蛋白酶抑制因子(basic pancreatic trypsinin hibitor BPTI，也称kunitz northrop 型抑制因子)。1946年Kunitz28又 从大豆中分离 了胰蛋白酶抑制因子，并将其结品化，证实了它们均为蛋白质，由此揭开了蛋白酶抑制因子 研究的序幕。目前,至少有14种蛋白酶抑制基因转入作物中。其中令人

14、注目的是豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CowpeuTrypsin Inbibitor，CPTI)，马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(Potato Proteinase InhibitorII，PI II)，及水稻巯基蛋白酶抑制基因(Oryzacystatin).Hinder等29应用CaMv35S基因启动 子使豇豆(Vigna unguiculata)胰蛋白酶抑制剂基因在烟草中行组成型表达，是利用植物自身基 因来控制害虫的范例。饲喂实验表明，CpTi 1 %的表达量延缓烟芽夜蛾(H. virescens)幼虫生 长，增加幼虫死亡率，减轻植物的损失。田间试验表明其对玉米夜蛾(H. zea)也有抗性3。 此后，

15、刘春明等克隆了CpTi的cDNA并获得了转基因烟草31。巯基蛋白酶抑制剂(TPI)对玉 米根部害虫(Diabrotica spp.)和根结线虫有明显的抑制作用32 。2.2.2淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因分布也较广，以禾谷类作物和豆科植物种子中的含量最为丰富，在植 物对病虫害侵染的天然防御系统中起着重要的作用33(Richardson,M.，1990)。这类酶抑制剂能 抑制昆虫消化道内a一淀粉酶活性，使食入的淀粉无法水解，阻断了昆虫主要能量来源；并刺 激昆虫过量分泌消化酶，通过神经系统反馈产生厌食反应。国外a一淀粉酶抑制剂研究起步较早，早在1933年在小麦以及1945年又在普通大豆上都曾

16、有过报道甲、35。国内酶抑制剂方面的研究始于70年代末。福建省微生物研究所从土壤中筛选 到产生粉酶抑制剂的产生菌S-2-35菌株，并对其代谢产物的分离及其理化性质进行深入研究， 研究成果显著声。2.2.3植物凝集素基因自从Stillmark (1888)首次在蓖麻种子抽提物中发现一种凝血因子和Sumner第一次分离 纯化到植物凝集素伴刀豆球蛋白A (ConA)以来，人们已经从豆科、茄科、大戟科、禾本科、百合科和石蒜科等众多植物类群中分离鉴定出几百种这类蛋白质，并对它们的性质、分 子结构及功能作了大量的研究，许多工作已深入到基因水平I。但直到本世纪60年代,人们认 识到凝集素在生物体内具有多种重

17、要生理功能，在医药、农业上具有巨大应用前景，凝集素 的研究文献才开始大量涌现。Peumans等认为一蛋白质被定义为lectin的唯一前提是至少应有一个非催化结构域，且其 能可逆结合在特异碳水化合物上。因此，现在植物凝集素定义为：含有至少一个非催化结构 域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的所有蛋白质39。第一个被描述具有抗虫作用的凝集素是菜豆凝集素(PHA) , 1984年Gatehouse40实验表 明PHA对四纹豆象的幼虫具有毒性。1993年英国科学工作者从雪花莲中克隆出雪花莲凝集 素基因(GNA)，对稻飞虱、叶蝉、蚜虫等有毒性作用。现伯NA基因已作为一种抗虫基因转 化其他作物。我国黄大昉等(

18、1997)组也报道来源于掌叶半夏和半夏的凝集素对麦管蚜、棉蚜、 桃蚜等有致死作用。凝集素抗虫的作用机制可能是在昆虫肠腔部位与糖蛋白结合，降低膜透 性，从而影响营养物质的正常吸收，同时诱发病灶，促进消化道内细菌繁殖，使昆虫得病或 引起拒食、生长停滞甚至死亡。目前研究较多的几种重要凝集素有：豌豆外源凝集素(pea - lectin)、麦胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin , WGA)、雪花莲凝集素(Galanthus Nivalis Agglutinin , GNA)、半夏外源凝集 素(Pinellia Ternata Agglutinin PTA)目前成功用于植物抗虫基因工程的

19、凝集素基因有:雪花莲凝 集素(GNA)基因、豌豆凝集素(P -Lec)基因、麦胚凝集素(WGA)基因、半夏凝集素(PTA)基 因。另外有研究报道，稻胚凝集素可以与N-乙酰葡萄胺专性结合，具有与麦胚凝集素相似 的杀虫活性，能阻碍昆虫的正常发育过程，导致其发育迟缓甚至死亡。我国王亦菲等(2000)42 以我国普通野生稻基因组DNA为模板，以特异引物经聚合酶链式反应方法扩增出凝集素基 因，为以后将稻胚凝集素基因应用于转基因植物打下了基础。凝集素虽可用来杀虫，但有些 凝集素对哺乳动物也有显著毒性，如麦胚凝集素、半夏凝集素，这样就使得这些凝集素不适 合用来转基因。而有些如豌豆凝集素和雪花莲凝集素对哺乳动

20、物的毒性相对较小，因此大部 分工作集中在了 GNA。GNA对刺吸式口器的害虫如蚜虫、褐飞虱等同翅目害虫及线虫具有 抗生效应。Gatehouse等(1996)43将GNA基因转入马铃薯，发现GNA可延缓马铃薯桃蚜的 发育期，降低其生殖力，抑制其种群生长。我国袁正强等(2001)申用定点突变方法对编码 雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin ,GNA)前体蛋白的DNA序列进行了改造和转基因 烟草(Nicotiana tabacum L .)抗蚜性的研究。结果表明，将GNA编码序列中含有的稀有密码子 改造后，GNA的表达水平从占总可溶性蛋白的0.17%增加到0.25%

21、，转基因烟草的抗蚜性也 随之增强，从平均抑制桃蚜(Myzusper sicae (Sulzer)虫口密度63.7%显著地提高到71.0%。天南星科半夏属植物三叶半夏(Pinellia Ternata)为我国特有的多年生草本药用植物，半 夏凝集素(Pinellia Ternata Agglutinin PTA)的粗提液对刺吸式口器的同翅目昆虫如棉蚜、 桃蚜等有显著的致死作用。凝胶过滤法测定的PTA分子量为44KDa，由四个约12KDa的亚基 组成，每个亚基具有三个甘露糖结合位点，与雪花莲凝集素(Galanthus Nivalis Agglutinin , GNA)的功能相似，具有凝血活性和抗同翅

22、目昆虫活性，复旦大学姚剑虹等(2003) 45用 RACE -PCR技术从半夏花序中克隆出半夏凝集素的生长cDNA。通过比较半夏同其他天南星 科植物的凝集素基因序列和推测的氨基酸序列，发现半夏凝集素基因编码一具有信号肽的前 体蛋白.半夏凝集素同其他天南星科植物凝集素一样，为具有3个甘露糖专结合的凝集素，张 磊等(2003) 46-47构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶(Npt II)为选择标记， 带有半夏凝集素基因PTA的pCAMBIA2200植物双元表达载体，应用根癌农杆WEHA105遗传 转化了四倍体菘蓝。2.2.4来源于高等植物的其他抗虫基因其他来源于高等植物的抗虫基因有

23、几丁质酶(Chitinase)、色氨酸脱羟酶(Tryptophan Decaiboxylase , TDC)、核糖体灭活基因(Ribosome Inactive Protein ,RIP)、豌豆脂肪氧化酶(Pea lipoxygenase)番茄素(Tomatime)、多酚氧化酶(PPO)和脂氧化酶(LOX)都对昆虫有毒害 作用。2.3昆虫特异性神经毒素基因昆虫神经激素是已知三大昆虫激素的一种，它控制着昆虫许多关键的生理过程，影响昆虫 的生长、变态、生殖、代谢和行为等，近年来，人们已开始在基因工程中利用昆虫神经激素 防治害虫。目前已证明转蝎毒素基因的作物对取食的害虫有毒性48。3新杀虫基因的应用

24、传统抗虫转基因主要是从人们熟知的具有杀虫能力的生物中克隆出来的，如从苏云金芽 孢杆菌中克隆Bt杀虫品体蛋白基因，而苏云金芽孢杆菌作为生物农药杀虫剂已在农业上应用 了几十年。新抗虫基因除了继续从这类已知具有杀虫能力的生物中克隆外(如营养杀虫蛋白基 因)，还采用了普遍筛选的方法，即用来作杀虫实验的样本可以是任意来源的植物组织、微生 物发酵液以及商品化的蛋白质等。采用对农业生产危害较大，但又不好控制的害虫作为筛选 实验对象。一旦出现杀虫效果明显的实验即进行跟踪鉴定，确定杀虫物质是否为蛋白质。如 果是蛋白质,则根据此蛋白的功能、杀虫效率、杀虫的作用机理来判断其作为新一代杀虫蛋白 的潜在价值。第二代抗虫

25、基因中的胆固醇氧化酶基因就是以此方法发现并克隆的49。3.1胆固醇氧化酶基因胆固醇氧化酶是胆固醇代谢过程中的一个关键酶，能催化胆固醇分解成4-胆甾烯-3酮 和过氧化氢。胆固醇氧化酶的杀虫谱相当宽，对鞘翅目、鳞翅目、双翅目、直翅目和同翅目 的害虫都有不同程度的作用5。3.2营养杀虫蛋白基因营养杀虫蛋白是另一类高效杀虫蛋白质，它的敏感害虫是另一种对Bt毒蛋白不敏感的重要 农业害虫鳞翅目的小地老虎。目前已发现了3个营养杀虫蛋白：从腊状芽胞杆菌(Bacillus cereus)培养物中分离出的Vipl，Vip2和从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ) 培养物中分离出的Vip

26、3A。这类蛋白可能与敏感昆虫表皮细胞，尤其是柱状细胞相结合，造成 细胞分解，伴随着肠道严重受损，受害昆虫迅速死亡。昆虫摄食Vip3A与Bt毒蛋白致毒表症类 似，但Vip3A发症时间要长些。日前Vip3A基因已获克隆，对它的研究也比较深入51。4抗虫基因工程潜在的问题、解决途径及展望伴随抗虫基因工程进展，其在应用方面潜在的问题也日益显露。近年来，随着转基因植物的商品化进程加快，有关生物安全性问题已成为人们研究和关注 的热点52-54。4.1抗虫转基因工程中昆虫的抗性问题害虫的抗性是指一个种群在遗传基础上降低了对某一种杀虫剂的敏感性。1988年，Mc Gauhey55报道了仓库谷物害虫印度谷螟在B

27、t选择压力下，繁殖75代后，对Bt杀虫剂的抗性增 加9。1。倍。目前较常采用的方法有：1，使用组织特异性表达启动子和损伤诱导启动子等特殊的启动 子56-58； 2，采取2个或2个以上不同杀虫机理的抗虫基因同时转入植物中59-60 ； 3，提供“避 难所Peferoen(1997)61等。4.2 基因沉默”现象无论是哪种来源的抗虫基因用于基因工程首要考虑的问题就是提高其表达量。一般来说， 表达量越高，抗虫效果就越好。导人的抗虫基因翻译水平不高是普遍存在的问题，因此，如 何提高外源抗虫基因在植物体内的表达，是植物抗虫基因工程的一个重要研究方向62。减少转基因沉默的主要方法有：1)改进转基因方法，尽

28、量避免多拷贝外源基因整合到受 体基因组中；2)筛选单拷贝转基因个体；3)采用具有特殊功能的启动子和增强子进行调控。随着人们对DNA空间结构、各种调控因子、环境因子及发育因子与转基因表达之间关系的深 入研究，转基因沉默现象终将会被克服。4.3转抗虫基因植物潜在的生态风险性转抗虫基因植物的安全性是一个长期、重要而且复杂的问题，应谨慎对待63。抗虫转基 因植物的直接生态效应是对靶标昆虫种群的控制，但靶标昆虫有无向其他寄主植物转移的可 能；害虫天敌种群会受到怎样的影响；次要害虫是否会变为主要害虫；靠转基因作物的逃逸 或从作物杂交中获取转基因抗性的植物是否会对自然植物群落产生严重影响都是需进一步研 究的

29、问题。为了防止转基因植物与它们的野生亲缘植物之间杂交，进而减少转基因植物的扩 散。目前，已有学者利用实验室中的烟草作试验，把不育基因和不育抑制基因分别嵌入烟草 中，当转基因烟草之间相互授粉后，由于不育抑制基因可以抑制不育基因，使得转基因烟草 可以产生能繁衍的种子。而当转基因烟草与非转基因烟草间授粉后，不育基因就可以防止不 纯烟草种子的萌发。为了防止选择基因或报告基因的潜在风险，目前，世界上已有许多实验 室正在研究无标记转化系统食4。4.4展望植物抗虫基因工程在短短十几年中已取得了丰硕成果，抗虫转基因棉花、玉米、马铃薯 的商业化推广证明了这项技术的实用性。另外，我们必须认识到，基因工程并非是解决

30、一切 问题的万全之策，通过植物基因工程得到的只是一种人工种质新材料，而不是生产上可以立 即应用的新品种，它必须经过常规育种考验。只有将传统的抗虫育种、遗传工程及田间综合 防治相互结合起来，才能更好地控制害虫发生，更好地改良植物。因此，植物基因工程技术 必须与常规育种相结合，并经大田试验将转基因植物的外源目的基因持续遗传给后代或通过 有性繁殖转移到其他品种上去。可以相信，随着研究的不断深入，目前存在于抗虫转基因工 程中的各种问题必将得到解决，必将有更多的抗虫作物新品种从实验室走向大田。在转基因植物体内，抗虫基因在植物整个生活周期中都存在并行使其抗虫功能，克服了使 用农药控制虫害的时效性和易被冲刷

31、、流失、分解等缺点，又防止了化学农药在食物中的残留 危害人体健康和对环境造成的污染等问题。多种抗虫基因的同时开发及其互补和协同作用， 对于控制昆虫产生抗性，提高抗虫植物的抗虫能力及抗虫范围前景是乐观的。我国在国家 863计划的支持下，抗虫棉研究也取得了巨大的进展，部分品种已推广大田种植65。但应 该指出，抗虫转基因植物并不是万能的，继续开发和利用化学农药，合理的田间生态控制和生 物防治的综合应用，才能解决当前日益严重的虫害问题。5参考文献夏启中，张明菊。抗植物虫害基因及其应用。鄂州大学学报，2005 (5)： 56-60冯 英,薛庆中。作物抗虫基因工程及其安全性。遗传，2001 (6)： 57

32、1-576Feeney P P. Plant apparency and chemical defense J . Recent Adv Phytochem,1976 ,10 :1 40Agrawal A. Induced responses to herbivory and increased plant performance J . Science ,1998 ,279 :1201 1202张汉尧，刘小珍，杨宇明。植物抗虫基因工程研究进展。河南农业科学，2005 (3)： 11-15陈业坚，张增勤等。Bt基因在农业上地应用及其生物安全性。上海农业科技，2005 (2)： 29-30Fis

33、chhoff D A , Bowdish K S , Perlak F J , et al. Biotechnology ,1987 ,5 : 807 813Vadlamudi R K, Weber E , Ji I. J Biol Chem. 1995 ,270 : 54905494Hilder VA，Gatehouse AMR，Sheernan SE，et a1. A novel mechanism of insect resistance engineered intotobaccoJ. Nature，1987，330： 160163Van Rie J， McGaughey WH， Jo

34、hnson DE. Mechanism of insect resistan ce to the microbial insecticideBacillusthuringiensisJ. Science， 1990(247)： 7274伍赠玲，邱君志，张新艳，李训波，关 雄。苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因定位研究进展。福建农林大学学报，2004 (3)： 75-79SCHN EPF H E, CR ICKMORE N , VAN R J , et a l. Bac illus thur ing ien s is and its p es ticida l crys ta l p roteins J

35、 . M icrobiolMolBiol Rev, 1998, 62 (3) : 775- 806Crickmore N , Zeigler D R , Feitelson J , et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev. ,1998,62 : 807813林敏.农业微生物基因工程M .北京:中国科技出版社,2000.41724851Schnepf H E , Whiteley H R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981 ,78 : 2893 2897李海涛，王洪成，刘志洋。Bt杀虫晶体蛋白的研究概述。黑龙江农业科学，2004 (5)：

36、 37-39Kumar P A , Sharma R P , Malik V S. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensisJ . Advances in Applied Microbiology , 1997 ,42 : 1243陈云鹏，陈火英，庄天明。B t毒蛋白基因在转基因抗虫植物中的应用.生物学通 报，2000，35(5):15-17BBarton K A , Whitely H R , Yang N S. Plant physiol. ,1987,85 :1103 1109Fischhoff D A , Bowdish K

37、 S , Perlak F J , et al. Biotechnology ,1987 ,5 : 807 813Hilder V A , Gatehouse A M R , Sheerman S E , et al. Nature ,1987,300 : 160163Vaeck M , Reynaerts A , Hofte H , et al. Nature , 1987,328 : 33 37郭三堆.植物B t抗虫基因工程研究进展J .中国农业科学，1995, 28 (5) : 813.顾万荣，李玉侠，张进，毛庆海，葛自强，陈德华。国产转基因抗虫棉研究进展。安徽农业科学，2005 (2)

38、： 324-325Krattiger AFInsect resistance in crops：A case study of BaciUusthuringiensis an d its transfer to developingCoLIntriesA. ISAAA Briefs No. 2M. ISAAA： Ithaca，NY. 1997. 411Smigocki A. et al. The Role of Transgenic Plants ,1997 ,225236Kunitz M,Northrop J H.Isolation from beef pancreas of crystal

39、line trypsinogen,trypsin,trypsin inhibitor and an inhibitor trypsin compoundJ.J Gen Physiol,1936,(19):991-1007Kunitz M, Crystalline sobean trpsin inhibitor IJ.J Gen Physiol,1946(29):149-154Hilder V A ,Gatehouse A M R ,Sheerman S M, et al. A novel mechanismof insect resistance engineered into tobacco

40、 J .Nature ,1987 ,330 :160163Hoffmann T C ,Zalom F G,Wilson L T , et al. Field evaluation of transgenic tobacco containing genes encoding Bacillus thuringiensis 5-endotoxins or cowpea trypsin inhibitor : efficacy against Helicoverpa zea (Lepidoptera : Noctuidae ) J . J Econ Entomol , 1992,85 : 2516

41、2522刘春明，朱 祯,周兆斓，等.豇豆胰蛋白酶抑制剂抗虫转基因烟草的获得J .科学通报,1992 ,37 (8) :16941697Edmonds H S ,Gatehouse L N ,Hilder V A , et al . The inhibitory effects of the cycteine protease inhibitor ,oryzacystatin ,on digestive proteases and on larval survival and development of the southern corn rootworm( Diabrotica undeci

42、mpunctata howard) J . Entomol Exp Appl ,1996 ,78 :83 94Richardson, M. (1990) Seed storage proteins: the enzyme inhibitors. In Methods in Plant Biochemistry (Rogers, L., ed.) 5,pp. 261 307. Academic Press, London, UKGibbs B F, Alli I. Characterization of a purifieel c-amylase inhibitor from white kid

43、ney beans (phaseolus vulganis). Food Research International, 1998,31:217-225Lajolo F M,Filho F F. Partial characterization of the amylase inhibitor of black beams (Phaseolus vulgaris), variety Rico23. J Agric Food Chem,1985,33:132-138徐成勇，诸葛建。微生物来源的酶抑制剂研究进展。微生物学报，1999, 39 (2)： 185 187Schoreder H E ,G

44、ollasch S ,Moore A , et al . Bean alpha - amylase inhibitor confers resistance to pea weeliv ( Bruchus pisorum) in transgenic peas (Pisum sativum L. ) J . Plant Physiol ,1995 ,107 :12331239高燕会，李润植，毛雪，李彩霞。植物凝集素的防卫功能及其研究进展。世界农业。2000 (12)： 3335Etzler M E ,1985. Plant lectins : Molecular and biological

45、aspects. Ann Rev Plant Physiol ,36 :209234Peumans WJ ,Van Damme E J M,1995. Lectins as plant defense proteins. Plant Physiol, 109 :347352Gatehouse A M R ,Dewey FM,Dove J ,Fenton KA , Pusztai A , 1984. Effect of seed lectins from Phaseolous valgaris on the devolepment of larvae of Callosbrchus macula

46、tus : Mechnism of toxity. J Sci Food Agric, 35 :373380黄大昉，潘映红，张淑香等。从掌叶半夏中发现对几种蚜虫有致死活性的蛋白。中国农业科学，1997, 30 (2)： 94 96王亦菲，黄剑华，郝峥嵘，刘庆法，曲志才，沈大棱。普通野生稻凝集素基因的克隆及序列分析。上海农业学报， 2000，16(1)：1316Gatehouse, A. M. R., R. E. Down, K. S. Powell, N. Sauvion, Y.Rahbe, C. A. Newell, A. Merryweather, W. D. O. Hamilton &

47、J. A. Gatehouse, 1996. Transgenic potato plants with enhanced resistance to the peach-potato aphid Myzus persicae. Entomologia Experimentalis et Applicata 79: 295-307袁正强，赵存友，周岩，田颖川。雪花莲凝集素基因(gna)的改造及其抗蚜性。植物学报，2001，43 (6)： 592 597Yao JH, Zhao XY Liao ZH, Lin J, Chen ZH, Chen F, Song J, Sun XF, Tang KX. Cloning and molecular characterization of a novel lectin gene from Pinellia ternata. Cell Res. 2003 Aug;13(4):301-8张磊，许铁峰，谭秋敏，王子楠，丁如贤，唐克轩，张汉明。四倍体菘蓝转抗虫基因研究I.根癌农杆菌介导的转 基因菘蓝。中草药，2003 (3)： 258-261许铁峰，张磊，刘成洪，谭秋敏，唐克轩，郭美丽，乔传卓，张汉明。四倍体菘蓝转抗虫基因研究II.转半夏凝集 素基因菘蓝的分子生物学检测。中草药，2003 (9)： 846-849Barton KA ,Miller