DB12-T521-2014牛结核病噬菌体检测技术规范

1、ICS 11.220B 41DB12天津市地方标准DB12/T 5212014牛结核病噬菌体检测技术规范The technicalstandard for detectionof bovine tuberculosis byMycobacteriophage2014-04-22 发布2014-07-20 实施天津市质量技术监督局发布DB12/T 5212014前言本标准的编写符合GB/T1.1-2009 的要求。本标准由天津市畜牧兽医局提出。本标准由天津市动物卫生监督所起草。本标准主要起草人：刘子芝、赵勇、李志荣、刘纪艳、尹望中、杨建华、周永燚、王颖、赵晶。本标准于2014年4月发布。I牛结核

2、病噬菌体检测技术规范范围本标准规定了噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的定义、设备和仪器、培养基和试剂、检测、结果判定、注意事项。本标准适用于牛结核病的疫病普查、监测和诊断。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法定义噬菌体 Bacteriophage,简称 phage噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌斑 plaque在人工培养基上，细菌在噬菌体的作用下裂解

3、形成的圆形斑，称为噬菌斑。设备和仪器a 生物安全柜b 离心机（4000 r/min）c 振荡器d 水浴锅（55 ）e 恒温培养箱f 有盖离心管（50 mL） g 无菌试管（10 mL） h 移液管（10 mL）三角瓶（100 mL，500 mL）平皿（90 mm）k 移液器及配套吸头（100 L，1000 L）培养基和试剂培养基和试剂配制方法见附录A检测样本的采集1按照NY/T 541 进行样本采集。样本的处理牛乳取牛乳 5 mL 于 50 mL 有盖离心管中，加 10 mL 的 3%NaoH 溶液；振荡混匀，室温孵育 15 min； 加灭菌完全培养基至 30 mL，4000 r/min 离心

4、 15 min，弃去上清液；再加灭菌完全培养基至 30 mL，4000 r/min 离心 15 min 后弃去上清液；加 1 mL 灭菌完全培养基重悬沉淀物，无菌条件下转移至 10 mL 无菌试管中。口鼻分泌物取2 mL牛口鼻分泌物（或2 mL保存液中的牛口鼻分泌物棉拭子样品）于50 mL有盖离心管中，处理方法同6.2.1。检测阴性对照：吸取1 mL灭菌完全培养基于10 mL无菌试管中，为“阴性对照”。阳性对照：取50 L指示细胞溶液用灭菌完全培养基稀释至1.0106 cfu/mL，取1 mL稀释后的溶液于10 mL无菌试管中，为“阳性对照”。灭菌双蒸水空白对照：灭菌双蒸水处理方法同 6.2.

5、1。在阳性对照、阴性对照、空白对照及样本管中分别加入100 L噬菌体D29溶液，混匀，于37 水浴锅中孵育2 h；上述反应管中分别加100 L杀病毒剂，充分混匀，置于室温10 min；上述反应管中分别加8 mL完全培养基，混匀；上述反应管中分别加1 mL指示细胞溶液，混匀；快速将反应管中所有的内容物分别倒入相应的空的90 mm的无菌平皿中；立即加8 mL冷却至55左右的琼脂培养基于各平皿中，快速混匀，置于室温定型；将平皿倒置于37培养箱中培养，18 h24 h后判读结果。结果判定当阳性对照平皿中噬菌斑数目20个，阴性对照平皿的噬菌斑数少于10个，同时无菌双蒸水空白对照均无噬菌斑时，试验成立。受

6、检样品平皿中出现大小不等的噬菌斑且20个噬菌斑，或许多噬菌斑相互融合成透明状判定为阳性；平皿中无噬菌斑出现或噬菌斑数量20个判定为阴性。注意事项试验前需将所有试剂和样本回复至室温。加入杀毒剂后一定要彻底摇匀，以杀死全部未进入菌体里的噬菌体。由于临床样本中可能含有病原体，因此所有操作过程应符合相关生物安全操作规程，如不得用口直接接触移液器，正确使用手套、生物安全罩衣、口罩等相应的安全防护设施。检测结束后，实验用品和废弃物，应进行高温高压或其他生物安全处理。2附录A（规范性附录） 培养基和试剂配制方法Middlebrook7H9 基础培养基将Middlebrook7H9基础培养基（自购）4.7 g

7、加入900 mL蒸馏水（或去离子水）中，充分混匀，溶解，121灭菌10 min，冷却至室温后使用。置于25下贮存，有效期4周。如该溶液污染（浑浊），则弃用。完全培养基无菌条件下，将小牛血清复合物20 mL加至无菌已冷却的180 mL7H9基础培养基中，制得完全培养基。4保存备用，有效期4周。如该溶液污染（浑浊），则弃用。3% NaoH溶液取NaoH 30 g，溶于1000 mL蒸馏水中，121灭菌10 min，冷却后备用。噬菌体D29溶液自购，用无菌完全培养基将噬菌体D29调至工作浓度为1.0108Pfu/mL，4保存备用。指示细胞溶液耻垢分枝杆菌（ATCC， 607， 自购），用无菌完全培养基将指示细胞配制成浓度为1.0106 cfu /mL， 4保存备用。杀病毒剂将50 mL浓硫酸加入到800 mL蒸馏水中，冷却后再溶入40 g硫酸亚铁铵。在容量瓶中稀释到1000 mL， 4保存备用。贮存过程中，该溶液可能褪色或产生沉淀，但不影响其使用。琼脂