人力资源HPLC培训教程

1、HPLCC培训教教程我国药典典收载高高效液相相色谱法法项目和和数量比比较表：方法项目数量19855年版19900年版19955年版20000年版HPLCC法鉴别934150检查1240160含量测定定760117387鉴于HPPLC应应用在药药品分析析中越来来越多，因因此每一一个药品品分析人人员应该该掌握并并应用HHPLCC。I概论论一、液相相色谱理理论发展展简况色谱法的的分离原原理是：溶于流流动相(mobbilee phhasee)中的的各组分分经过固固定相时时，由于于与固定定相(sstattionnaryy phhasee)发生生作用（吸吸附、分分配、离离子吸引引、排阻阻、亲和和）的大大小

2、、强强弱不同同，在固固定相中中滞留时时间不同同，从而而先后从从固定相相中流出出。又称称为色层层法、层层析法。色谱法最最早是由由俄国植植物学家家茨维特特（Tsswettt）在在19006年研研究用碳碳酸钙分分离植物物色素时时发现的的，色谱谱法(CChroomattogrraphhy)因因之得名名。后来来在此基基础上发发展出纸纸色谱法法、薄层层色谱法法、气相相色谱法法、液相相色谱法法。液相色谱谱法开始始阶段是是用大直直径的玻玻璃管柱柱在室温温和常压压下用液液位差输输送流动动相，称称为经典典液相色色谱法，此此方法柱柱效低、时间长长（常有有几个小小时）。高效液液相色谱谱法(HHighh peerfoo

3、rmaancee LiiquiidChhrommatoograaphyy，HPPLC)是在经经典液相相色谱法法的基础础上，于于60年年代后期期引入了了气相色色谱理论论而迅速速发展起起来的。它与经经典液相相色谱法法的区别别是填料料颗粒小小而均匀匀，小颗颗粒具有有高柱效效，但会会引起高高阻力，需需用高压压输送流流动相，故故又称高高压液相相色谱法法(Hiigh Preessuure LiqquiddChrromaatoggrapphy，HHPLCC)。又又因分析析速度快快而称为为高速液液相色谱谱法(HHighh Sppeedd LiiquiidChhrommatoograaphyy，HSSLP)。也

4、称称现代液液相色谱谱。二、HPPLC的的特点和和优点HPLCC有以下下特点：高压压压力可达达15003000Kgg/cmm2。色色谱柱每每米降压压为755 Kgg/cmm2以上上。高速流流速为00.110.0 mml/mmin。高效可可达50000塔塔板每米米。在一一根柱中中同时分分离成份份可达1100种种。高灵敏度度紫外外检测器器灵敏度度可达00.011ng。同时消消耗样品品少。HPLCC与经典典液相色色谱相比比有以下下优点：速度快通常分分析一个个样品在在1530 minn，有些些样品甚甚至在55 miin内即即可完成成。分辨率高高可选选择固定定相和流流动相以以达到最最佳分离离效果。灵敏度高

5、高紫外外检测器器可达00.011ng，荧荧光和电电化学检检测器可可达0.1pgg。柱子可反反复使用用用一一根色谱谱柱可分分离不同同的化合合物。样品量少少，容易易回收样品经经过色谱谱柱后不不被破坏坏，可以以收集单单一组分分或做制制备。三、色谱谱法分类类按两相的的物理状状态可分分为：气气相色谱谱法(GGC)和和液相色色谱法(LC)。气相相色谱法法适用于于分离挥挥发性化化合物。GC根根据固定定相不同同又可分分为气固固色谱法法(GSSC)和和气液色色谱法(GLCC)，其其中以GGLC应应用最广广。液相相色谱法法适用于于分离低低挥发性性或非挥挥发性、热稳定定性差的的物质。LC同同样可分分为液固固色谱法法

6、(LSSC)和和液液色色谱法(LLCC)。此此外还有有超临界界流体色色谱法(SFCC)，它它以超临临界流体体（界于于气体和和液体之之间的一一种物相相）为流流动相（常常用COO2），因因其扩散散系数大大，能很很快达到到平衡，故故分析时时间短，特特别适用用于手性性化合物物的拆分分。按原理分分为吸附附色谱法法(ACC)、分分配色谱谱法(DDC)、离子交交换色谱谱法(IIEC)、排阻阻色谱法法(ECC，又称称分子筛筛、凝胶胶过滤(GFCC)、凝凝胶渗透透色谱法法(GPPC）和和亲和色色谱法。(此外还还有电泳泳。)按操作形形式可分分为纸色色谱法(PC)、薄层层色谱法法(TLLC)、柱色谱谱法。四、色谱谱

7、分离原原理高效液相相色谱法法按分离离机制的的不同分分为液固固吸附色色谱法、液液分分配色谱谱法（正正相与反反相）、离子交交换色谱谱法、离离子对色色谱法及及分子排排阻色谱谱法。1液固固色谱法法使用用固体吸吸附剂，被被分离组组分在色色谱柱上上分离原原理是根根据固定定相对组组分吸附附力大小小不同而而分离。分离过过程是一一个吸附附解吸吸附的平平衡过程程。常用用的吸附附剂为硅硅胶或氧氧化铝，粒粒度510m。适适用于分分离分子子量2000110000的组分分，大多多数用于于非离子子型化合合物，离离子型化化合物易易产生拖拖尾。常常用于分分离同分分异构体体。2液液液色谱法法使用用将特定定的液态态物质涂涂于担体体

8、表面，或或化学键键合于担担体表面面而形成成的固定定相，分分离原理理是根据据被分离离的组分分在流动动相和固固定相中中溶解度度不同而而分离。分离过过程是一一个分配配平衡过过程。涂布式固固定相应应具有良良好的惰惰性；流流动相必必须预先先用固定定相饱和和，以减减少固定定相从担担体表面面流失；温度的的变化和和不同批批号流动动相的区区别常引引起柱子子的变化化；另外外在流动动相中存存在的固固定相也也使样品品的分离离和收集集复杂化化。由于于涂布式式固定相相很难避避免固定定液流失失，现在在已很少少采用。现在多多采用的的是化学学键合固固定相，如如C188、C88、氨基基柱、氰氰基柱和和苯基柱柱。液液色谱谱法按固固

9、定相和和流动相相的极性性不同可可分为正正相色谱谱法(NNPC)和反相相色谱法法(RPPC)。正相色谱谱法采采用极性性固定相相(如聚乙乙二醇、氨基与与腈基键键合相)；流动动相为相相对非极极性的疏疏水性溶溶剂(烷烃类类如正已已烷、环环已烷），常常加入乙乙醇、异异丙醇、四氢呋呋喃、三三氯甲烷烷等以调调节组分分的保留留时间。常用于于分离中中等极性性和极性性较强的的化合物物(如酚类类、胺类类、羰基基类及氨氨基酸类类等）。反相色谱谱法一一般用非非极性固固定相（如如C188、C88）；流流动相为为水或缓缓冲液，常常加入甲甲醇、乙乙腈、异异丙醇、丙酮、四氢呋呋喃等与与水互溶溶的有机机溶剂以以调节保保留时间间。

10、适用用于分离离非极性性和极性性较弱的的化合物物。RPPC在现现代液相相色谱中中应用最最为广泛泛，据统统计，它它占整个个HPLLC应用用的800%左右右。随着柱填填料的快快速发展展，反相相色谱法法的应用用范围逐逐渐扩大大，现已已应用于于某些无无机样品品或易解解离样品品的分析析。为控控制样品品在分析析过程的的解离，常常用缓冲冲液控制制流动相相的pHH值。但但需要注注意的是是，C118和CC8使用用的pHH值通常常为2.577.5（228），太太高的ppH值会会使硅胶胶溶解，太太低的ppH值会会使键合合的烷基基脱落。有报告告新商品品柱可在在pH 1.55100范围操操作。正相色谱谱法与反反相色谱谱法

11、比较较表正相色谱谱法反相相色谱法法固定相极极性高中中低流动相极极性低中中高组分洗脱脱次序极极性小先先洗出极极性大先先洗出从上表可可看出，当当极性为为中等时时正相色色谱法与与反相色色谱法没没有明显显的界线线（如氨氨基键合合固定相相）。3离子子交换色色谱法固定相相是离子子交换树树脂，常常用苯乙乙烯与二二乙烯交交联形成成的聚合合物骨架架，在表表面未端端芳环上上接上羧羧基、磺磺酸基（称称阳离子子交换树树脂）或或季氨基基（阴离离子交换换树脂）。被分离离组分在在色谱柱柱上分离离原理是是树脂上上可电离离离子与与流动相相中具有有相同电电荷的离离子及被被测组分分的离子子进行可可逆交换换，根据据各离子子与离子子交

12、换基基团具有有不同的的电荷吸吸引力而而分离。缓冲液常常用作离离子交换换色谱的的流动相相。被分分离组分分在离子子交换柱柱中的保保留时间间除跟组组分离子子与树脂脂上的离离子交换换基团作作用强弱弱有关外外，它还还受流动动相的ppH值和和离子强强度影响响。pHH值可改改变化合合物的解解离程度度，进而而影响其其与固定定相的作作用。流流动相的的盐浓度度大，则则离子强强度高，不不利于样样品的解解离，导导致样品品较快流流出。离子交换换色谱法法主要用用于分析析有机酸酸、氨基基酸、多多肽及核核酸。4离子子对色谱谱法又又称偶离离子色谱谱法，是是液液色色谱法的的分支。它是根根据被测测组分离离子与离离子对试试剂离子子形

13、成中中性的离离子对化化合物后后，在非非极性固固定相中中溶解度度增大，从从而使其其分离效效果改善善。主要要用于分分析离子子强度大大的酸碱碱物质。分析碱性性物质常常用的离离子对试试剂为烷烷基磺酸酸盐，如如戊烷磺磺酸钠、辛烷磺磺酸钠等等。另外外高氯酸酸、三氟氟乙酸也也可与多多种碱性性样品形形成很强强的离子子对。分析酸性性物质常常用四丁丁基季铵铵盐，如如四丁基基溴化铵铵、四丁丁基铵磷磷酸盐。离子对色色谱法常常用ODDS柱（即即C188），流流动相为为甲醇-水或乙乙腈-水水，水中中加入33100 mmmol/L的离离子对试试剂，在在一定的的pH值值范围内内进行分分离。被被测组分分保时间间与离子子对性质质

14、、浓度度、流动动相组成成及其ppH值、离子强强度有关关。5排阻阻色谱法法固定定相是有有一定孔孔径的多多孔性填填料，流流动相是是可以溶溶解样品品的溶剂剂。小分分子量的的化合物物可以进进入孔中中，滞留留时间长长；大分分子量的的化合物物不能进进入孔中中，直接接随流动动相流出出。它利利用分子子筛对分分子量大大小不同同的各组组分排阻阻能力的的差异而而完成分分离。常常用于分分离高分分子化合合物，如如组织提提取物、多肽、蛋白质质、核酸酸等。被分离组组分在柱柱中的洗洗脱原理理II基基本概念念和理论论一、基本本概念和和术语1色谱谱图和峰峰参数色谱图(chrromaatoggramm)样品流流经色谱谱柱和检检测器

15、，所所得到的的信号-时间曲曲线，又又称色谱谱流出曲曲线(eeluttionn prrofiile)。基线(bbasee liine)经流流动相冲冲洗，柱柱与流动动相达到到平衡后后，检测测器测出出一段时时间的流流出曲线线。一般般应平行行于时间间轴。噪音(nnoisse)基线线信号的的波动。通常因因电源接接触不良良或瞬时时过载、检测器器不稳定定、流动动相含有有气泡或或色谱柱柱被污染染所致。漂移(ddrifft)基线线随时间间的缓缓缓变化。主要由由于操作作条件如如电压、温度、流动相相及流量量的不稳稳定所引引起，柱柱内的污污染物或或固定相相不断被被洗脱下下来也会会产生漂漂移。色谱峰(peaak)组分分

16、流经检检测器时时响应的的连续信信号产生生的曲线线。流出出曲线上上的突起起部分。正常色色谱峰近近似于对对称形正正态分布布曲线（高高斯Gaausss曲线）。不对称称色谱峰峰有两种种：前延延峰(lleaddingg peeak)和拖尾尾峰(ttaillingg peeak)。前者者少见。拖尾因子子(taailiing facctorr，T)TT，用用以衡量量色谱峰峰的对称称性。也也称为对对称因子子(syymmeetryy faactoor)或或不对称称因子(asyymmeetryy faactoor)。中国国药典规规定T应应为0.951.005。TT0.95为为前延峰峰，T1.005为拖拖尾峰。峰底

17、基基线上峰峰的起点点至终点点的距离离。峰高(ppeakk heeighht，hh)峰峰的最高高点至峰峰底的距距离。峰宽（ppeakk wiidthh，W)峰两两侧拐点点处所作作两条切切线与基基线的两两个交点点间的距距离。WW4半峰宽（peaak wwidtth aathaalf-heiightt，Whh/2)峰高高一半处处的峰宽宽。Whh/22.3355标准偏差差（staandaard devviattionn，)正态态分布曲曲线x1时时（拐点点）的峰峰宽之半半。正常常峰的拐拐点在峰峰高的00.6007倍处处。标准准偏差的的大小说说明组分分在流出出色谱柱柱过程中中的分散散程度。小，分分散程度度

18、小、极极点浓度度高、峰峰形瘦、柱效高高；反之之，大大，峰形形胖、柱柱效低。峰面积(peaak aareaa，A)峰与与峰底所所包围的的面积。Ahh2.5077h1.0064 Wh/2h2定性性参数（保保留值）死时间(deaad ttimee，t00)不保留留组分的的保留时时间。即即流动相相（溶剂剂）通过过色谱柱柱的时间间。在反反相HPPLC中中可用苯苯磺酸钠钠来测定定死时间间。死体积(deaad vvoluume，VV0)由进样样器进样样口到检检测器流流动池未未被固定定相所占占据的空空间。它它包括44部分：进样器器至色谱谱柱管路路体积、柱内固固定相颗颗粒间隙隙（被流流动相占占据，VVm）、柱出

19、口口管路体体积、检检测器流流动池体体积。其其中只有有Vm参参与色谱谱平衡过过程，其其它3部部分只起起峰扩展展作用。为防止止峰扩展展，这33部分体体积应尽尽量减小小。V00Ft0（F为为流速）保留时间间(rettenttionn tiime，ttR)从进样样开始到到某个组组分在柱柱后出现现浓度极极大值的的时间。保留体积积(rettenttionn voolumme，VVR)从进样样开始到到某组分分在柱后后出现浓浓度极大大值时流流出溶剂剂的体积积。又称称洗脱体体积。VVRFFtRR调整保留留时间(adjjustted rettenttionn结构tiime，ttR)扣除死死时间后后的保留留时间。也

20、称折折合保留留时间(redduceed rreteentiionttimee)。在在实验条条件（温温度、固固定相等等）一定定时，ttR只决定定于组分分的性质质，因此此，tR（或ttR）可用用于定性性。tRtRt0调整保留留体积(adjjustted rettenttionnvollumee，VR)扣除死死体积后后的保留留体积。VRRVRV0或VRFtRR3柱效效参数理论塔板板数(theeoreeticcal plaatennumbber，NN)用于定定量表示示色谱柱柱的分离离效率（简简称柱效效）。N取决于于固定相相的种类类、性质质（粒度度、粒径径分布等等）、填填充状况况、柱长长、流动动相的种种

21、类和流流速及测测定柱效效所用物物质的性性质。如如果峰形形对称并并符合正正态分布布，N可可近似表表示为：N()216()25.554()2N为常量量时，WW随tRR成正比比例变化化。在一一张多组组分色谱谱图上，如如果各组组分含量量相当，则则后洗脱脱的峰比比前面的的峰要逐逐渐加宽宽，峰高高则逐渐渐降低。用半峰宽宽计算理理论塔数数比用峰峰宽计算算更为方方便和常常用，因因为半峰峰宽更易易准确测测定，尤尤其是对对稍有拖拖尾的峰峰。N与柱长长成正比比，柱越越长，NN越大。用N表表示柱效效时应注注明柱长长，如果果未注明明，则表表示柱长长为1米米时的理理论塔板板数。（一一般HPPLC柱柱的N在在10000以上

22、上。）若用调整整保留时时间(ttR)计算算理论塔塔板数，所所得值称称为有效效理论塔塔板数(N有效效或Nefff)。理论塔板板高度(theeoreeticcal plaatehheigght，HH)每单位位柱长的的方差。H。实际应应用时往往往用柱柱长L和和理论塔塔板数计计算：HH，HH有效。4相平平衡参数数分配系数数(disstriibuttionncoeeffiicieent，KK)在一定定温度下下，化合合物在两两相间达达到分配配平衡时时，在固固定相与与流动相相中的浓浓度之比比。K。分配系数数与组分分、流动动相和固固定相的的热力学学性质有有关，也也与温度度、压力力有关。在不同同的色谱谱分离机机

23、制中，KK有不同同的概念念：吸附附色谱法法为吸附附系数，离离子交换换色谱法法为选择择性系数数(或称交交换系数数)，凝胶胶色谱法法为渗透透参数。但一般般情况可可用分配配系数来来表示。在条件(流动相相、固定定相、温温度和压压力等)一定，样样品浓度度很低时时(Cs、Cm很很小)时，KK只取决决于组分分的性质质，而与与浓度无无关。这这只是理理想状态态下的色色谱条件件，在这这种条件件下，得得到的色色谱峰为为正常峰峰；在许许多情况况下，随随着浓度度的增大大，K减减小，这这时色谱谱峰为拖拖尾峰；而有时时随着溶溶质浓度度增大，KK也增大大，这时时色谱峰峰为前延延峰。因因此，只只有尽可可能减少少进样量量，使组组

24、分在柱柱内浓度度降低，KK恒定时时，才能能获得正正常峰。在同一色色谱条件件下，样样品中KK值大的的组分在在固定相相中滞留留时间长长，后流流出色谱谱柱；KK值小的的组分则则滞留时时间短，先先流出色色谱柱。混合物物中各组组分的分分配系数数相差越越大，越越容易分分离，因因此混合合物中各各组分的的分配系系数不同同是色谱谱分离的的前提。在HPLLC中，固固定相确确定后，KK主要受受流动相相的性质质影响。实践中中主要靠靠调整流流动相的的组成配配比及ppH值，以以获得组组分间的的分配系系数差异异及适宜宜的保留留时间，达达到分离离的目的的。容量因子子(cappaciity facctorr，k)化化合物在在两

25、相间间达到分分配平衡衡时，在在固定相相与流动动相中的的量之比比。k。因此此容量因因子也称称质量分分配系数数。分配系数数、容量量因子与与保留时时间之间间有如下下关系：kK，tRk t0。上式式说明容容量因子子的物理理意义：表示一一个组分分在固定定相中停停留的时时间（ttR）是不不保留组组分保留留时间（tt0）的几几倍。kk0时时，化合合物全部部存在于于流动相相中，在在固定相相中不保保留，ttR0；k越大大，说明明固定相相对此组组分的容容量越大大，出柱柱慢，保保留时间间越长。容量因子子与分配配系数的的不同点点是：KK取决于于组分、流动相相、固定定相的性性质及温温度，而而与体积积Vs、Vm无无关；k

26、k除了与与性质及及温度有有关外，还还与Vss、Vmm有关。由于ttR、t0较Vss、Vmm易于测测定，所所以容量量因子比比分配系系数应用用更广泛泛。选择性因因子(sellecttiviity facctorr，)相相邻两组组分的分分配系数数或容量量因子之之比。（设设k2k1）。因ktRR/t0，则，所所以又又称为相相对保留留时间（美美国药典典）。要使两组组分得到到分离，必必须使1。与化化合物在在固定相相和流动动相中的的分配性性质、柱柱温有关关，与柱柱尺寸、流速、填充情情况无关关。从本本质上来来说，的大小小表示两两组分在在两相间间的平衡衡分配热热力学性性质的差差异，即即分子间间相互作作用力的的差

27、异。5分离离参数分离度(ressoluutioon，RR)相邻两两峰的保保留时间间之差与与平均峰峰宽的比比值。也也叫分辨辨率，表表示相邻邻两峰的的分离程程度。RR。当当W1W2时时，R。当RR1时时，称为为4分分离，两两峰基本本分离，裸裸露峰面面积为995.44%，内内侧峰基基重叠约约2%。R11.5时时，称为为6分分离，裸裸露峰面面积为999.77%。RR1.5称为为完全分分离。中国药药典规规定R应应大于11.5。基本分离离方程分离离度与三三个色谱谱基本参参数有如如下关系系:R其中称为为柱效项项，为柱柱选择性性项，为为柱容量量项。柱柱效项与与色谱过过程动力力学特性性有关，后后两项与与色谱过过

28、程热力力学因素素有关。从基本分分离方程程可看出出，提高高分离度度有三种种途径：增加加塔板数数。方法法之一是是增加柱柱长，但但这样会会延长保保留时间间、增加加柱压。更好的的方法是是降低塔塔板高度度，提高高柱效。增加加选择性性。当1时时，R0，无无论柱效效有多高高，组分分也不可可能分离离。一般般可以采采取以下下措施来来改变选选择性：a. 改变流流动相的的组成及及pH值值；b. 改变变柱温；c. 改变固固定相。改变变容量因因子。这这常常是是提高分分离度的的最容易易方法，可可以通过过调节流流动相的的组成来来实现。k2趋趋于0时时，R也也趋于00；k22增大，RR也增大大。但kk2不能能太大，否否则不但

29、但分离时时间延长长，而且且峰形变变宽，会会影响分分离度和和检测灵灵敏度。一般kk2在11100范围内内，最好好为25，窄窄径柱可可更小些些。二、塔板板理论1塔板板理论的的基本假假设塔板理论论是Maartiin和SSyngger首首先提出出的色谱谱热力学学平衡理理论。它它把色谱谱柱看作作分馏塔塔，把组组分在色色谱柱内内的分离离过程看看成在分分馏塔中中的分馏馏过程，即即组分在在塔板间间隔内的的分配平平衡过程程。塔板板理论的的基本假假设为：1） 色色谱柱内内存在许许多塔板板，组分分在塔板板间隔（即即塔板高高度）内内完全服服从分配配定律，并并很快达达到分配配平衡。2） 样样品加在在第0号号塔板上上，样

30、品品沿色谱谱柱轴方方向的扩扩散可以以忽略。3） 流流动相在在色谱柱柱内间歇歇式流动动，每次次进入一一个塔板板体积。4） 在在所有塔塔板上分分配系数数相等，与与组分的的量无关关。虽然以上上假设与与实际色色谱过程程不符，如如色谱过过程是一一个动态态过程，很很难达到到分配平平衡；组组分沿色色谱柱轴轴方向的的扩散是是不可避避免的。但是塔塔板理论论导出了了色谱流流出曲线线方程，成成功地解解释了流流出曲线线的形状状、浓度度极大点点的位置置，能够够评价色色谱柱柱柱效。2色谱谱流出曲曲线方程程及定量量参数（峰峰高h和和峰面积积A）根据塔板板理论，流流出曲线线可用下下述正态态分布方方程来描描述：CCe或或Cee

31、由色谱流流出曲线线方程可可知：当当tttR时，浓浓度C有有极大值值，Cmmax。Cmmax就就是色谱谱峰的峰峰高。因因此上式式说明：当实实验条件件一定时时（即一定），峰峰高h与与组分的的量C00（进样样量）成成正比，所所以正常常峰的峰峰高可用用于定量量分析。当进进样量一一定时，越小（柱柱效越高高），峰峰高越高高，因此此提高柱柱效能提提高HPPLC分分析的灵灵敏度。由流出曲曲线方程程对V(0)求积积分，即即得出色色谱峰面面积ACmaaxCC0。可见见A相当当于组分分进样量量C0，因此此是常用用的定量量参数。把Cmmaxh和WWh/222.3555代入入上式，即即得A1.0064Wh/2hh，此为

32、为正常峰峰的峰面面积计算算公式。三、速率率理论（又又称随机机模型理理论）1液相相色谱速速率方程程19566年荷兰兰学者VVan Deeemteer等人人吸收了了塔板理理论的概概念，并并把影响响塔板高高度的动动力学因因素结合合起来，提提出了色色谱过程程的动力力学理论论速速率理论论。它把把色谱过过程看作作一个动动态非平平衡过程程，研究究过程中中的动力力学因素素对峰展展宽（即即柱效）的的影响。后来Giiddiingss和Snnydeer等人人在Vaan DDeemmterr方程（HHAB/uuCuu，后称称气相色色谱速率率方程）的的基础上上，根据据液体与与气体的的性质差差异，提提出了液液相色谱谱速率

33、方方程（即即Gidddinngs方方程）：H22dppsuup5(2psup55(2ppssupp5(22f2影响响柱效的的因素1）涡流流扩散（eeddyy diiffuusioon）。由于色色谱柱内内填充剂剂的几何何结构不不同，分分子在色色谱柱中中的流速速不同而而引起的的峰展宽宽。涡流流扩散项项A22dpp，dpp为填料料直径，为填充充不规则则因子，填填充越不不均匀越大。HPLLC常用用填料粒粒度一般般为310m，最最好35mm，粒度度分布RRSD5%。但粒度度太小难难于填充充均匀（大），且且会使柱柱压过高高。大而而均匀（球球形或近近球形）的的颗粒容容易填充充规则均均匀，越小。总的说说来，应

34、应采用细细而均匀匀的载体体，这样样有助于于提高柱柱效。毛毛细管无无填料，AA0。2）分子子扩散（mmoleecullar difffussionn）。又又称纵向向扩散。由于进进样后溶溶质分子子在柱内内存在浓浓度梯度度，导致致轴向扩扩散而引引起的峰峰展宽。分子扩扩散项BB/u2DDm/uu。u为为流动相相线速度度，分子子在柱内内的滞留留时间越越长（uu小），展展宽越严严重。在在低流速速时，它它对峰形形的影响响较大。Dm为为分子在在流动相相中的扩扩散系数数，由于于液相的的Dm很很小，通通常仅为为气相的的10-4110-55，因此此在HPPLC中中，只要要流速不不太低的的话，这这一项可可以忽略略不计

35、。是考考虑到填填料的存存在使溶溶质分子子不能自自由地轴轴向扩散散，而引引入的柱柱参数，用用以对Dmm进行校校正。一般在在0.660.7左右右，毛细细管柱的的11。3）传质质阻抗（mmasss trranssferrressisttancce）。由于溶溶质分子子在流动动相、静静态流动动相和固固定相中中的传质质过程而而导致的的峰展宽宽。溶质质分子在在流动相相和固定定相中的的扩散、分配、转移的的过程并并不是瞬瞬间达到到平衡，实实际传质质速度是是有限的的，这一一时间上上的滞后后使色谱谱柱总是是在非平平衡状态态下工作作，从而而产生峰峰展宽。液相色色谱的传传质阻抗抗项Cuu又分为为三项。流动相相传质阻阻抗

36、HmmCmmd2ppu/DDm，CCm为常常数。这这是由于于在一个个流路中中流路中中心和边边缘的流流速不等等所致。靠近填填充颗粒粒的流动动相流速速较慢，而而中心较较快，处处于中心心的分子子还未来来得及与与固定相相达到分分配平衡衡就随流流动相前前移，因因而产生生峰展宽宽。静态流流动相传传质阻抗抗HsmmCssmd22pu/Dm，CCsm为为常数。这是由由于溶质质分子进进入处于于固定相相孔穴内内的静止止流动相相中，晚晚回到流流路中而而引起峰峰展宽。Hsmm对峰展展宽的影影响在整整个传质质过程中中起着主主要作用用。固定定相的颗颗粒越小小，微孔孔孔径越越大，传传质阻力力就越小小，传质质速率越越高。所所

37、以改进进固定相相结构，减减小静态态流动相相传质阻阻力，是是提高液液相色谱谱柱效的的关键。Hm和HHsm都都与固定定相的粒粒径平方方d2pp 成正正比，与与扩散系系数Dmm成反比比。因此此应采用用低粒度度固定相相和低粘粘度流动动相。高高柱温可可以增大大Dm，但但用有机机溶剂作作流动相相时，易易产生气气泡，因因此一般般采用室室温。固定相相传质阻阻抗HssCssd2ffu/DDs（液液液分配配色谱），CCs为常常数，ddf为固固定液的的液膜厚厚度，DDs为分分子在固固定液中中的扩散散系数。在分配配色谱中中Hs与与df的的平方成成正比，在在吸附色色谱中HHs与吸吸附和解解吸速度度成反比比。因此此只有在

38、在厚涂层层固定液液、深孔孔离子交交换树脂脂或解吸吸速度慢慢的吸附附色谱中中，Hss才有明明显影响响。采用用单分子子层的化化学键合合固定相相时Hss可以忽忽略。从速率方方程式可可以看出出，要获获得高效效能的色色谱分析析，一般般可采用用以下措措施：进样时时间要短短。填填料粒度度要小。改善善传质过过程。过过高的吸吸附作用用力可导导致严重重的峰展展宽和拖拖尾，甚甚至不可可逆吸附附。适适当的流流速。以以H对uu作图，则则有一最最佳线速速度uoopt，在在此线速速度时，HH最小。一般在在液相色色谱中，uuoptt很小（大大约0.030.11mm/s），在在这样的的线速度度下分析析样品需需要很长长时间，一一

39、般来说说都选在在1mmm/s的的条件下下操作。较小小的检测测器死体体积。3柱外外效应速率理论论研究的的是柱内内峰展宽宽因素，实实际在柱柱外还存存在引起起峰展宽宽的因素素，即柱柱外效应应（色谱谱峰在柱柱外死空空间里的的扩展效效应）。色谱峰峰展宽的的总方差差等于各各方差之之和，即即：22柱内内22柱外2其其它柱外外效应主主要由低低劣的进进样技术术、从进进样点到到检测池池之间除除柱子本本身以外外的所有有死体积积所引起起。为了了减少柱柱外效应应，首先先应尽可可能减少少柱外死死体积，如如使用“零零死体积积接头”连连接各部部件，管管道对接接宜呈流流线形，检检测器的的内腔体体积应尽尽可能小小。研究究表明柱柱

40、外死体体积之和和应VVR/。其次，希希望将样样品直接接进在柱柱头的中中心部位位，但是是由于进进样阀与与柱间有有接头，柱柱外效应应总是存存在的。此外，要要求进样样体积VR/2。柱外效应应的直观观标志是是容量因因子k小小的组分分（如kk2）峰峰形拖尾尾和峰宽宽增加得得更为明明显；kk大的组组分影响响不显著著。由于于HPLLC的特特殊条件件，当柱柱子本身身效率越越高（NN越大），柱柱尺寸越越小时，柱柱外效应应越显得得突出。而在经经典LCC中则影影响相对对较小。IIIHPLLC系统统HPLCC系统一一般由输输液泵、进样器器、色谱谱柱、检检测器、数据记记录及处处理装置置等组成成。其中中输液泵泵、色谱谱柱

41、、检检测器是是关键部部件。有有的仪器器还有梯梯度洗脱脱装置、在线脱脱气机、自动进进样器、预柱或或保护柱柱、柱温温控制器器等，现现代HPPLC仪仪还有微微机控制制系统，进进行自动动化仪器器控制和和数据处处理。制制备型HHPLCC仪还备备有自动动馏分收收集装置置。最早的液液相色谱谱仪由粗粗糙的高高压泵、低效的的柱、固固定波长长的检测测器、绘绘图仪，绘绘出的峰峰是通过过手工测测量计算算峰面积积。后来来的高压压泵精度度很高并并可编程程进行梯梯度洗脱脱，柱填填料从单单一品种种发展至至几百种种类型，检检测器从从单波长长至可变变波长检检测器、可得三三维色谱谱图的二二极管阵阵列检测测器、可可确证物物质结构构的

42、质谱谱检测器器。数据据处理不不再用绘绘图仪，逐逐渐取而而代之的的是最简简单的积积分仪、计算机机、工作作站及网网络处理理系统。目前常见见的HPPLC仪仪生产厂厂家国外外有Waaterrs公司司、Aggileent公公司（原原HP公公司）、岛津公公司等，国国内有大大连依利利特公司司、上海海分析仪仪器厂、北京分分析仪器器厂等。一、输液液泵1泵的的构造和和性能输液泵是是HPLLC系统统中最重重要的部部件之一一。泵的的性能好好坏直接接影响到到整个系系统的质质量和分分析结果果的可靠靠性。输输液泵应应具备如如下性能能：流流量稳定定，其RRSD应应0.5%，这这对定性性定量的的准确性性至关重重要；流量范范围宽

43、，分分析型应应在0.1110 mml/mmin范范围内连连续可调调，制备备型应能能达到1100 ml/minn；输输出压力力高，一一般应能能达到11503000kg/cm22；液液缸容积积小；密封性性能好，耐耐腐蚀。泵的种类类很多，按按输液性性质可分分为恒压压泵和恒恒流泵。恒流泵泵按结构构又可分分为螺旋旋注射泵泵、柱塞塞往复泵泵和隔膜膜往复泵泵。恒压压泵受柱柱阻影响响，流量量不稳定定；螺旋旋泵缸体体太大，这这两种泵泵已被淘淘汰。目目前应用用最多的的是柱塞塞往复泵泵。柱塞往复复泵的液液缸容积积小，可可至0.1mll，因此此易于清清洗和更更换流动动相，特特别适合合于再循循环和梯梯度洗脱脱；改变变电

44、机转转速能方方便地调调节流量量，流量量不受柱柱阻影响响；泵压压可达4400kg/ccm2。其主要要缺点是是输出的的脉冲性性较大，现现多采用用双泵系系统来克克服。双双泵按连连接方式式可分为为并联式式和串联联式，一一般说来来并联泵泵的流量量重现性性较好（RRSD为为0.11%左右右，串联联泵为00.20.33%），但但出故障障的机会会较多（因因多一单单向阀），价价格也较较贵。各品牌输输液泵的的基本参参数：项目Wateers 5155型HP 111000型LC-110ATTvp型型Elitte PP2000 III型检定要求求流速范围围0.00011100.00011100.000199.99990

45、.0114.99调节精度度0.00010.00010.00010.011流量精密密度RSD00.1%0.155%（0.33%）0.3%0.5%1.5%流量准确确度2.00%5.00%2.00%最高压力力40000 Pssi40 MMPa39.22MPaa40.00MPaa密封圈寿寿命流动相的的脉冲2泵的的使用和和维护注注意事项项为了延长长泵的使使用寿命命和维持持其输液液的稳定定性，必必须按照照下列注注意事项项进行操操作：防止任任何固体体微粒进进入泵体体，因为为尘埃或或其它任任何杂质质微粒都都会磨损损柱塞、密封环环、缸体体和单向向阀，因因此应预预先除去去流动相相中的任任何固体体微粒。流动相相最好

46、在在玻璃容容器内蒸蒸馏，而而常用的的方法是是滤过，可可采用MMilllipoore滤滤膜（00.2&miccro;m或00.455&miicroo;m）等等滤器。泵的入入口都应应连接砂砂滤棒（或或片）。输液泵泵的滤器器应经常常清洗或或更换。流动相相不应含含有任何何腐蚀性性物质，含含有缓冲冲液的流流动相不不应保留留在泵内内，尤其其是在停停泵过夜夜或更长长时间的的情况下下。如果果将含缓缓冲液的的流动相相留在泵泵内，由由于蒸发发或泄漏漏，甚至至只是由由于溶液液的静置置，就可可能析出出盐的微微细晶体体，这些些晶体将将和上述述固体微微粒一样样损坏密密封环和和柱塞等等。因此此，必须须泵入纯纯水将泵泵充分清

47、清洗后，再再换成适适合于色色谱柱保保存和有有利于泵泵维护的的溶剂（对对于反相相键合硅硅胶固定定相，可可以是甲甲醇或甲甲醇-水水）。泵工作作时要留留心防止止溶剂瓶瓶内的流流动相被被用完，否否则空泵泵运转也也会磨损损柱塞、缸体或或密封环环，最终终产生漏漏液。输液泵泵的工作作压力决决不要超超过规定定的最高高压力，否否则会使使高压密密封环变变形，产产生漏液液。流动相相应该先先脱气，以以免在泵泵内产生生气泡，影影响流量量的稳定定性，如如果有大大量气泡泡，泵就就无法正正常工作作。如果输液液泵产生生故障，须须查明原原因，采采取相应应措施排排除故障障：没有流流动相流流出，又又无压力力指示。原因可可能是泵泵内有

48、大大量气体体，这时时可打开开泄压阀阀，使泵泵在较大大流量（如如5mll/miin）下下运转，将将气泡排排尽，也也可用一一个500ml针针筒在泵泵出口处处帮助抽抽出气体体。另一一个可能能原因是是密封环环磨损，需需更换。压力和和流量不不稳。原原因可能能是气泡泡，需要要排除；或者是是单向阀阀内有异异物，可可卸下单单向阀，浸浸入丙酮酮内超声声清洗。有时可可能是砂砂滤棒内内有气泡泡，或被被盐的微微细晶粒粒或滋生生的微生生物部分分堵塞，这这时，可可卸下砂砂滤棒浸浸入流动动相内超超声除气气泡，或或将砂滤滤棒浸入入稀酸（如如4mool/LL硝酸）内内迅速除除去微生生物，或或将盐溶溶解，再再立即清清洗。压力过过

49、高的原原因是管管路被堵堵塞，需需要清除除和清洗洗。压力力降低的的原因则则可能是是管路有有泄漏。检查堵堵塞或泄泄漏时应应逐段进进行。3梯度度洗脱HPLCC有等强强度(iisoccrattic)和梯度度(grradiientt)洗脱脱两种方方式。等等度洗脱脱是在同同一分析析周期内内流动相相组成保保持恒定定，适合合于组分分数目较较少，性性质差别别不大的的样品。梯度洗洗脱是在在一个分分析周期期内程序序控制流流动相的的组成，如如溶剂的的极性、离子强强度和ppH值等等，用于于分析组组分数目目多、性性质差异异较大的的复杂样样品。采采用梯度度洗脱可可以缩短短分析时时间，提提高分离离度，改改善峰形形，提高高检测

50、灵灵敏度，但但是常常常引起基基线漂移移和降低低重现性性。梯度洗脱脱有两种种实现方方式：低低压梯度度（外梯梯度）和和高压梯梯度（内内梯度）。两种溶剂剂组成的的梯度洗洗脱可按按任意程程度混合合，即有有多种洗洗脱曲线线：线性性梯度、凹形梯梯度、凸凸形梯度度和阶梯梯形梯度度。线性性梯度最最常用，尤尤其适合合于在反反相柱上上进行梯梯度洗脱脱。在进行梯梯度洗脱脱时，由由于多种种溶剂混混合，而而且组成成不断变变化，因因此带来来一些特特殊问题题，必须须充分重重视：要注意意溶剂的的互溶性性，不相相混溶的的溶剂不不能用作作梯度洗洗脱的流流动相。有些溶溶剂在一一定比例例内混溶溶，超出出范围后后就不互互溶，使使用时更

51、更要引起起注意。当有机机溶剂和和缓冲液液混合时时，还可可能析出出盐的晶晶体，尤尤其使用用磷酸盐盐时需特特别小心心。梯度洗洗脱所用用的溶剂剂纯度要要求更高高，以保保证良好好的重现现性。进进行样品品分析前前必须进进行空白白梯度洗洗脱，以以辨认溶溶剂杂质质峰，因因为弱溶溶剂中的的杂质富富集在色色谱柱头头后会被被强溶剂剂洗脱下下来。用用于梯度度洗脱的的溶剂需需彻底脱脱气，以以防止混混合时产产生气泡泡。混合溶溶剂的粘粘度常随随组成而而变化，因因而在梯梯度洗脱脱时常出出现压力力的变化化。例如如甲醇和和水粘度度都较小小，当二二者以相相近比例例混合时时粘度增增大很多多，此时时的柱压压大约是是甲醇或或水为流流动

52、相时时的两倍倍。因此此要注意意防止梯梯度洗脱脱过程中中压力超超过输液液泵或色色谱柱能能承受的的最大压压力。每次梯梯度洗脱脱之后必必须对色色谱柱进进行再生生处理，使使其恢复复到初始始状态。需让110330倍柱柱容积的的初始流流动相流流经色谱谱柱，使使固定相相与初始始流动相相达到完完全平衡衡。二、进样样器早期使用用隔膜和和停流进进样器，装装在色谱谱柱入口口处。现现在大都都使用六六通进样样阀或自自动进样样器。进进样装置置要求：密封性性好，死死体积小小，重复复性好，保保证中心心进样，进进样时对对色谱系系统的压压力、流流量影响响小。HHPLCC进样方方式可分分为：隔隔膜进样样、停流流进样、阀进样样、自动

53、动进样。1隔膜膜进样。用微量量注射器器将样品品注入专专门设计计的与色色谱柱相相连的进进样头内内，可把把样品直直接送到到柱头填填充床的的中心，死死体积几几乎等于于零，可可以获得得最佳的的柱效，且且价格便便宜，操操作方便便。但不不能在高高压下使使用（如如10MMPa以以上）；此外隔隔膜容易易吸附样样品产生生记忆效效应，使使进样重重复性只只能达到到122%；加加之能耐耐各种溶溶剂的橡橡皮不易易找到，常常规分析析使用受受到限制制。2停流流进样。可避免免在高压压下进样样。但在在HPLLC中由由于隔膜膜的污染染，停泵泵或重新新启动时时往往会会出现“鬼鬼峰”；另一缺缺点是保保留时间间不准。在以峰峰的始末末信

54、号控控制馏分分收集的的制备色色谱中，效效果较好好。3阀进进样。一一般HPPLC分分析常用用六通进进样阀（以以美国RRheoodynne公司司的77725和和77225i型型最常见见），其其关键部部件由圆圆形密封封垫（转转子）和和固定底底座（定定子）组组成。由由于阀接接头和连连接管死死体积的的存在，柱柱效率低低于隔膜膜进样（约约下降55100%左右右），但但耐高压压（355400MPaa），进进样量准准确，重重复性好好（0.5%），操操作方便便。六通阀的的进样方方式有部部分装液液法和完完全装液液法两种种。用用部分装装液法进进样时，进进样量应应不大于于定量环环体积的的50%（最多多75），并并要求

55、每每次进样样体积准准确、相相同。此此法进样样的准确确度和重重复性决决定于注注射器取取样的熟熟练程度度，而且且易产生生由进样样引起的的峰展宽宽。用用完全装装液法进进样时，进进样量应应不小于于定量环环体积的的5110倍（最最少3倍倍），这这样才能能完全置置换定量量环内的的流动相相，消除除管壁效效应，确确保进样样的准确确度及重重复性。六通阀使使用和维维护注意意事项：样品品溶液进进样前必必须用00.455&miicroo;m滤滤膜过滤滤，以减减少微粒粒对进样样阀的磨磨损。转动阀阀芯时不不能太慢慢，更不不能停留留在中间间位置，否否则流动动相受阻阻，使泵泵内压力力剧增，甚甚至超过过泵的最最大压力力；再转转

56、到进样样位时，过过高的压压力将使使柱头损损坏。为防止止缓冲盐盐和样品品残留在在进样阀阀中，每每次分析析结束后后应冲洗洗进样阀阀。通常常可用水水冲洗，或或先用能能溶解样样品的溶溶剂冲洗洗，再用用水冲洗洗。4自动动进样。用于大大量样品品的常规规分析。三、色谱谱柱色谱是一一种分离离分析手手段，分分离是核核心，因因此担负负分离作作用的色色谱柱是是色谱系系统的心心脏。对对色谱柱柱的要求求是柱效效高、选选择性好好，分析析速度快快等。市市售的用用于HPPLC的的各种微微粒填料料如多孔孔硅胶以以及以硅硅胶为基基质的键键合相、氧化铝铝、有机机聚合物物微球（包包括离子子交换树树脂）、多孔碳碳等，其其粒度一一般为3

57、3,5,7,110mm等，柱柱效理论论值可达达5116万/米。对对于一般般的分析析只需550000塔板数数的柱效效；对于于同系物物分析，只只要5000即可可；对于于较难分分离物质质对则可可采用高高达2万万的柱子子，因此此一般110330cmm左右的的柱长就就能满足足复杂混混合物分分析的需需要。柱效受柱柱内外因因素影响响，为使使色谱柱柱达到最最佳效率率，除柱柱外死体体积要小小外，还还要有合合理的柱柱结构（尽尽可能减减少填充充床以外外的死体体积）及及装填技技术。即即使最好好的装填填技术，在在柱中心心部位和和沿管壁壁部位的的填充情情况总是是不一样样的，靠靠近管壁壁的部位位比较疏疏松，易易产生沟沟流，

58、流流速较快快，影响响冲洗剂剂的流形形，使谱谱带加宽宽，这就就是管壁壁效应。这种管管壁区大大约是从从管壁向向内算起起30倍倍粒径的的厚度。在一般般的液相相色谱系系统中，柱柱外效应应对柱效效的影响响远远大大于管壁壁效应。1柱的的构造色谱柱由由柱管、压帽、卡套（密密封环）、筛板（滤滤片）、接头、螺丝等等组成。柱管多多用不锈锈钢制成成，压力力不高于于70 kg/cm22时，也也可采用用厚壁玻玻璃或石石英管，管管内壁要要求有很很高的光光洁度。为提高高柱效，减减小管壁壁效应，不不锈钢柱柱内壁多多经过抛抛光。也也有人在在不锈钢钢柱内壁壁涂敷氟氟塑料以以提高内内壁的光光洁度，其其效果与与抛光相相同。还还有使用

59、用熔融硅硅或玻璃璃衬里的的，用于于细管柱柱。色谱谱柱两端端的柱接接头内装装有筛板板，是烧烧结不锈锈钢或钛钛合金，孔孔径0.2220&mmicrro;mm(510&miccro;m)，取取决于填填料粒度度，目的的是防止止填料漏漏出。色谱柱按按用途可可分为分分析型和和制备型型两类，尺尺寸规格格也不同同：常常规分析析柱（常常量柱），内内径25mmm（常用用4.66mm，国国内有44mm和和5mmm），柱柱长100300cm；窄径径柱（nnarrrow borre，又又称细管管径柱、半微柱柱semmi-mmicrrocoolummn），内内径12mmm，柱长长1020ccm；毛细管管柱（又又称微柱柱m

60、iccroccoluumn），内内径0.200.5mmm；半制备备柱，内内径55mm；实验验室制备备柱，内内径200400mm，柱柱长100300cm；生产产制备柱柱内径可可达几十十厘米。柱内径径一般是是根据柱柱长、填填料粒径径和折合合流速来来确定，目目的是为为了避免免管壁效效应。2柱的的发展方方向因强调分分析速度度而发展展出短柱柱，柱长长3110cmm，填料料粒径223&miccro;m。为为提高分分析灵敏敏度，与与质谱(MS)联接，而而发展出出窄径柱柱、毛细细管柱和和内径小小于0.2mmm的微径径柱（mmicrroboore）。细管径径柱的优优点是：节省省流动相相；灵灵敏度增增加；样品量量