-第四章 植物细胞培养与次生代谢产物的生产课件 高中生物竞赛

1、第四章 植物组织培养生产次生代谢产物一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义二、植物细胞培养生产次生代谢产物 细胞、组织、器官培养三、培养方式、方法、设备四、提取方式 （简介）植物能生产的物质：药物、精油、食品、化工产品精油3-5秒穿透皮肤真皮、皮下组织；5-8分钟进入人体的血液及淋巴系统;4-12小时围绕人体一周，携带毒素自由排出体外。 玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一 一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义茉莉精油被称为“精油之王”。茉莉精油产量极少因而十分昂贵，其具有高雅气味，可舒缓郁闷情绪、振

2、奋精神、提升自信心，同时可护理和善肌肤干燥、缺水、过油及敏感的状况，淡化妊娠纹与疤痕，增加皮肤弹性，让肌肤倍感柔嫩。 基础理论细胞全能性植物组织培养的目的之一-次生代谢物质生产培养工艺：方法、方式、设备 药用植物资源由于自然环境的破坏,无计划的采挖或栽培困难等原因而日益减少,用植物细胞培养生产天然化合物将逐渐成为弥补天然资源短缺的有效途径。二、植物细胞培养生产次生代谢产物（一）药用植物细胞培养世界现代制药工业起步于第二次世界大战后的国际经济复兴。药品的巨大的社会效益和经济效益，刺激了制药工业在50-70年代以较高 的速度蓬勃发展。药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年成交额达300亿美元近年来

3、,由于生物技术发展的突飞猛进,药用植物细胞大量培养技术正成为国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量上超过或等于原植物 紫草、黄莲、人参、彩叶紫苏,毛地黄等培养细胞都已实现工厂化生产,显示出药用植物细胞培养生产天然药物的巨大前瞻性和潜在应用前景.1、药用植物研究状况.克服天然药物因结构复杂,无法合成或合成反应步骤多、成本高昂(喜树碱、东莨菪碱、三尖杉酯碱等)而无法商业化生产的限制,依靠培养细胞自身酶系统,人工控制下高效合成目的药用化合物。2、细胞培养技术的优点主要在于：.生产周期短,不破坏野生资

4、源及生态环境,不占用耕地,不受气候、季节等环境的影响,没有污染,符合绿色中草药的发展趋势。1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定 和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。国内外细胞培养的研究进展2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。 初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。3）近年来，更加关注的领域： 植物体各器官间的协同作用对次生代谢产物合成的影响比如： 金雀花芽

5、和毛状根共培养生产植物金雀异黄酮(动情激素)、人参和桔 梗不定根(人参皂苷) A0DC三七体细胞胚发生及其生物反应器培养4) 利用体细胞胚生物反应器培养生产次生代谢产物(二) 植物细胞培养植物细胞培养（plant cell culture）在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。细胞系-1.1单细胞分离 1）机械方法： （1）从完整植物器官和组织中分离单细胞 叶肉细胞光合和呼吸良好 松散的愈伤组织-反复悬浮-单细胞 （2）低速离心洗涤-单细胞 直接在显微镜下用吸管吸取单个细胞或用密度梯度离心后再 吸取单个细胞 1单细胞培养2）化学方法：化学试剂使细胞分散 如

6、：草酸盐处理胡萝卜细胞悬浮培养物-分散细胞 秋水仙素、CH、2,4-D对分散细胞都有一定作用3）酶处理：果胶酶处理-细胞分散1.2 分离细胞的特点：应根据细胞的种类、培养条件、研究目的选择（1）物理方法操作方便，不会改变细胞的生理特性，对正常细胞生长和分 化以及生理生化等方面的研究比较合适；（2）化学方法和酶法获得的分散细胞数量大，但会引起细胞的某些改变。 禾本科植物的叶片用酶法分离比较困难。（3）除显微镜操作吸取单个细胞外，多数方法获得的单细胞系一般都有 小细胞团。1）看护培养 (nurse culture)也称饲喂培养用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞生长和增殖的方法1.3单细胞培养方

7、法： 2）继代培养（增殖）固体培养： 采用固体培养基进行继代培养是常用的细胞纯化和保存方式。营养吸收、气体交换等条件不均匀，难获得均匀一致的细胞群体液体培养： 采用液体培养基进行细胞培养可以保证细胞与营养比较充分的接触，操作简便，生长速度快。 2 植物细胞的悬浮培养细胞悬浮培养（cell suspension culture）是将植物细胞和小的细胞团悬浮于液体培养基中，在保持细胞良好分散状态下进行培养的技术。与固体培养比较的优点1）细胞生长和增殖速度快 2）增加了细胞与培养液的接触面积，改善了营养供应；3）可避免有害代谢物在局部浓度过高；4）有利于氧气充分供应意义：1）有利于在细胞水平上进行各

8、种遗传操作和生理生化等方面的研究2）也适于植物细胞的工业化大规模培养及生产有价值的细胞代谢产物2.1 细胞悬浮培养的一般过程1）疏松愈伤组织的诱导 材料：最佳幼胚 愈伤组织质量好、增殖速度快、分化与再生植株的能力强培养条件：培养基、植物激素 天然附加物 种类、浓度、比例2）单细胞的分离与细胞悬浮培养 （1）悬浮震荡培养100-120转/分 （2）过筛40-120目 （3）离心：1000-1500r/min 3-5min (4) 细胞密度计算：细胞计数：离心后，1/3摇匀，血球计数板 （5）细胞活力测定：酚藏红花溶液染色和FDA 3）愈伤组织形成 -大量细胞增殖 -大规模培养 -次生代谢物质生产

9、悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养2.2 细胞悬浮培养工艺1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基，也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。 细胞生长特点： 培养物的生长曲线一般都遵循一种固定的模式： （1）S形曲线 （2）延迟期 （3）对数生长期 （4）直线生长期 （5）减慢期 （6）静止期特点：（1）操作简单，培养周期短（2）直观反映细胞生长代谢过程 适合研究营养消耗、细胞生长、代谢产物积累规律（3）可直接放大 缺点： 不能控制底物浓度、细胞易老化、生长周期

10、短、效率低2）流加式培养（feeding culture） 在分批培养过程中，间歇或连续地补加一种或多种营养成分的培养方法。细胞初始接种的培养液体积，一般为终体积的1/2-1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求补加营养，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平。 整个过程无培养液的流出或产品的收集 与分批培养相比，流加式培养的优点：（1）可根据细胞生长速率、营养物消耗情况，保证合理、充足的营养（2）可减少产物反馈抑制，排除有害代谢产物积累带来的细胞损伤。细胞 不易老化（3）可延长指数生长期，从而提高细胞浓度，延长细胞培养周期。 产物浓度较高，又能实现连续收获3)连

11、续培养（continuous culture） 是指在培养过程中，不断排出悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到营养物质补充并保持其恒定体积的培养。特点：细胞能在近似恒定状态下生长,营养、产物浓度、pH基本可保持恒定，细胞维持持续指数增长。存在的问题：（1）一直有细胞收获，浓度一般不高（2）细胞分裂快、易变异 （3）易于污染（4）对设备、仪器的控制技术要求较高。 4) 半连续培养（semi-continuous culture）又称 重复分批培养或换液培养。培养过程中，每隔一定时间抽取出一定量的培养液或者细胞，剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原有体积，使生物反应器内的总体积不

12、变。每次稀释培养体积的1/2-3/4，以维持细胞的指数生长状态。特点：（1）细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培 养过程可延续很长时间。（2）可进行多次收获（3）操作简便，生产效率高两相培养技术生物反应器培养技术三、细胞培养培养技术1、两相培养技术：在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相。细胞在水相中生长，合成的次生代谢物质分泌出来后转移至有机相中。优点：（1）减少了产物的反馈抑制作用，从而可以提高产物含量（2）可以通过有机相的不断回收及循环使用，实现培养的连续化实例：紫草细胞悬浮培养加入十六烷-可以原位提取紫草素，而且可以是含量提高7.4倍。长春花细胞中加入XAD-7大孔吸附树脂，可以使吲哚生物碱的含量提高孔雀草发根合成的噻吩中仅有1%左右分泌到培养基中。当培养体系中加入十六烷进行两相培养，可使30%-70%的噻吩分泌出来十六烷分子式C16H34。无色液体；熔点18.2,沸点287.149,密度0.7733克/厘米。有多种异构体 溶解性： 不溶于水，微溶于乙醇，易溶于乙醚。 主要用途：用作合成原料、溶剂、气相色谱固定液、气相色谱对