生物工艺学第2章 基因工程工具酶1课件

1、第 二章 基因工程工具酶 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 基因工程工具酶 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA 进而降解非己 DNA 的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程工具酶基因工程工具酶及其

2、应用限制性核酸内切酶主要用于DNA分子的特异切割DNA连接酶用于DNA和RNA的连接DNA聚合酶用于DNA和RNA的合成核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。限制性核酸内切酶(restriction enzyme)限制性核酸内切酶(restriction enzyme)限制性内切酶的发现 限制性内切酶的分类 限制性内切酶的命名 限制性内切酶的活性单位 限制性内切酶的切割特点 限制性内切酶的反应条件 限制性内切酶的应用 一 . 限制性内切酶的概念核酸酶可分为两类：

3、核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。 限制性核酸内切酶的发现 细菌的限制修饰作用1952 年，Luria 和 Human， 1953年，Bertani 和 Weigle 发现细菌的限制（restriction）现象：Phage（k） E.coli kE .coli B【E .coli B 限制 （k）】感染不感染R-M 系统 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制修饰系统 (R-M Restriction-modification s

4、ystem)。 R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。 限制性内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现1968 Linn 和 Arber 从 E.coli B 中发现限制酶 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DN

5、A 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。EcoR IEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。 限制性核酸内切酶的命名EcoR 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 不同核酸内切酶的特异识别位点Pst5 C T G C A G3 3 G A C G T C .5 A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割位点核酸内切酶Hind对双链DN

6、A分子的切割作用三、种酶切末端 平齐末端（如 Sma、Alu、Hae） 5-GG CC-3 3-CC GG-5 5-GG- -CC-3 3-CC- -GG-5 5粘性末端（如 EcoR ） 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 5-G- -AATTC-3 3-CTTAA- -G-5 3粘性末端（如 Pst ）同裂酶和同尾酶 同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。 如：Hpa和 Msp均可切割 C CGG。 当胞嘧啶甲基化后， Msp不能再切割。 同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后 DNA 分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切

7、酶。 2.反应系统因素 （1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 如：型酶需 Mg2+，若以 Mn2+ 代替Mg2+（如Hind，EcoRI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 （3）牛血清蛋白 (BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。限制性核酸内切酶的反应条件3. 星活性 限制性内切酶识别特异性放宽。 EcoR在正常情况下识别 GAATTC 序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过 5%，其识别位点发生松动，可在 AATT 处发生切割，EcoR这种特殊的识别能力叫做星活性，用 EcoR*表示。星活性可造成位点切割机率不

8、等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度 12-20%，酶与 DNA 比例，离子强度，45% 聚乙二醇 (PEG)，有机溶剂，8% 二甲基亚枫，二价阳离子，12% 乙醇。 限制性核酸内切酶的反应条件重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 限制性核酸内切酶的应用重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 限制性核酸内切酶的应用 甲基化酶分两类： 维持性甲基化酶：用于在新合

9、成的 DNA 链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。 构建性甲基化酶：用于在非甲基化的 DNA 链上进行甲基化的酶。 用甲基化酶进行甲基化的作用 封闭 DNA 链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。 构建新的酶切位点DNA连接酶（ligase） 能够催化 DNA 中相邻的 3-羟基和 5-磷酸基末端之间形成3，5-磷酸二酯键; T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子.ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut)

10、3HO P53HO P5AATTC GG CTTAAAATTC GG CTTAA5 555(1) (2)AATTC GG CTTAAAATTC G G CTTAA55AATTC GG CTTAA5 5(a)分子间连接(b)分子内连接(1) (2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶一. DNA的连接方法 两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构. 1. 直接连结法-该法适用于: 1)同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端 重组DNA可用同种酶再切开 2) 不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端 i.重组DNA分子不能

11、再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI 3) PCR产物与特定载体的连接 4) 限制酶和其他方式产生的平末端.3. 匹配接头连接法人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子:i. 平端 + 突起末端(5-突起, 3-突起)ii.粘性末端 (5-突起 + 5-突起: EcoRI+HindIII 5-突起 + 3-突起: EcoR

12、I+PstI 3-突起 + 3-突起: PstI+SacI)1)匹配接头的结构特点 i. 由两个低聚核苷酸组成 ii. 部分区域可以互补 iii. 退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2)匹配接头的种类 i. 预制匹配接头(连接平端和粘性末端) 人工接头 + 匹配接头 预制匹配接头 ii. 转换匹配接头(连接5-突起和3-突起末端) 二匹配接头退火 转换匹配接头 二人工接头 连接酶 双酶切 转换匹配接头 iii. 单链匹配接头(连接5-突起和3-突起末端)4. 同聚物加尾连接法 在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物,即AT或GC.5. 连接方法的选择 方法选择的依据: 1

13、) 两DNA分子的末端结构 2) DNA 分子的限制酶谱 3) 是否需要回收DNA片段连接方式的选择载体末端 外源DNA末端 常规连接 脱磷酸化 同聚物 平端连接 补齐,人工接头 结构 结构 载体 加尾 外切酶 5-突起 相容5-突起 第二选择 第一选择 不能 不能 不能 5-突起 非相容5-突起 不能 结合使用接头 不能 不能 第一选择 3-突起 相容3-突起 唯一选择 不能 不能 不能 不能 3-突起 非相容3-突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择 或平端 3-突起 5-端突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择 (补齐后) 平端 平端 不能 可能 可能 第一选择 可能 平端 3-

14、或5-突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择二. DNA的连接反应 1. 连接反应理论 当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关: 1)连接反应系统中的总DNA浓度i 2)一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度j, 该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化) 3)两种不同DNA分子的克分子浓度之比值. 2. 连接反应条件 1)评估连接反应结果的方法 i. 琼脂糖凝胶电泳 ii.大肠杆菌转化 2)反应条件 i. 温度 ii. ATP浓度 iii. 时间 iv. 连接酶浓度 v.克分子比率DNA 聚合酶（DNA po

15、lymerase）DNA 聚合酶 指在 DNA (或 RNA) 模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物 3 OH 末端聚合DNA 链的一类酶。 DNA 聚合酶在 DNA复制时起关键作用。 DNA 聚合酶主要有三类：聚合酶（pol），聚合酶(pol) ，聚合酶(pol)。其中聚合酶参与 DNA 修复，聚合酶参与 DNA 复制。聚合酶是基因工程中的常用酶。 DNA 聚合酶和 的比较DNA 聚合酶的特点： 需模板 (DNA 或 RNA)； 需引物； 具有三种酶活性，即 53聚合酶活性；53外切酶活性和 35外切外切酶活性。DNA 聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶在

16、 DNA 复制过程中的作用1、 53聚合酶活性： CCG GGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+，4dNTPCCGATAGCC GGCTATCGG2、53外切酶活性 3、35外切酶活性 GATAGCC AGCTATCGGTCGATAGCC AGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+ pC，pT5TCGATAGCC AGCTATE.coli DNApolIMg 2+TCGATA AGCTAT+ pC，pG，pC5DNA 聚合酶的三种活性DNA 的切口平移（nick translation） DNA 聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过 DNA 缺口平移，制备供核酸分

17、子杂交用的带放射性标记的 DNA 探针。此时， DNA 聚合酶的 5- 3核酸外切酶活性和 5-3 聚合酶活性同时发生。5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 5-3外切酶活性5-3聚合酶活性5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 未经标记的核苷酸经标记的核苷酸DNA 杂交探针的制备5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 *(a)(b)(c)(d)(e)(a) 双链的DNA分子(b) 带有3-OH末端的单链缺口(c) pol从5-P移去一个核苷酸(d) pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e) 重复(c)(d)的步骤，缺口沿

18、5-3方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链探针（probe） 探针：用来探知被测物存在的小 DNA 或RNA叫做探针。 标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。 分子杂交：探针 DNA 或 RNA 与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）DNA聚合酶 来源 E.coli，由染色体 DNA 基因编码。商品上用的此酶来源于 Phage NM964 整合的溶源性 E.coli。 结构 一条多肽链，MW = 109，000 D。 活性 5 3聚合，3 5和 53外切。Klenow来源： E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大

19、片段 (Klenow 和 Henningseon.1970DNApol枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶C 端 (76kd) + N 端（36kd） Klenow 5 3聚合 3 5外切 5 3外切 Klenow 用途 填补限制酶的 5-粘性末端为平齐末端 5CC 3GGAATT5CCTTAA3 3GGAATT5 Klenow3-末端标记 Klenow 在无底物时只进行 3 5外切；有底物存在时则聚合。 这种标记也称作交换标记，但 Klenow 作用不如T4DNA聚合酶。T4DNA 聚合酶 来源：T4Phage 感染的 E.coli 结构：MW=114,000 d 活性： 53聚合活性； 35外切活性，

20、对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比 Klenow 大 200 倍 用途 填补或标记限制酶切后产生的 5- 粘性末端的3-凹缺末端。（同 Klenow） 3- 粘性末端的标记制备 DNA探针,同 Klenow 末端标记。 T7DNA聚合酶（测序酶） 来源：T7 Phage 感染的 E.coli 结构：由 2 个蛋白亚基组成： T7 phage gene 5 蛋白 + 宿主硫氧蛋白 活性： 53聚合，持续反应时间最长，所以合成的 DNA 链长。故在 DNA 测序中很优越。 35外切，是 DNA 聚合酶的 1000倍。用途 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 用填补或交换反应快速进行末端标

21、记。 与 TDNApol一样，平齐粘性末端。 定点突变中互补链的合成。53 35修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶) 来源： 天然 TDNA 聚合酶经修饰处理 结构： 同T聚合酶。 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe+与酶保温几天，可使Phage T7 gene5 蛋白 N- 端35外切酶活性中心失活 (O- 修饰)。 即：53聚合酶作用提高，持续性长。3 5外切作用下降 99% 以上。 Taq DNA 聚合酶(Thermusaqraticus) 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种 结构：单亚基 MW = 94,000 d。 活性：聚合最适温度为 75-80，不具35外切酶活性，具53外切

22、活性 。 用途： PCR 反应。 测序，高温下进行 DNA 合成可减少模板二级结构。末端转移酶 (不依赖模板的 DNA 聚合酶) 来源：只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的 DNA 聚合酶 (Chang 和Bollum,1986)。 结构 ：MW = 60,000 d. 活性：催化 dNTP 掺入 DNA 3-OH 末端，形成同聚物末端；反应不需模板 DNA，需 Co2+ 用途： 克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。 末端标记反转录酶(reverse transcriptase) 来源：商品反转录酶有两种 来自禽类成髓细胞瘤病毒 (AMV)。 来自能表达 Moloney 鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶基因的 E.coli。 结构