植物组培培养基及其配制

1、植物组培培养基及其配制1=培养基好比土壤，是组织培养中离体材料赖以生存和发展的基地。因 此，在组织培养基的各个环节中，应着重掌握培养基，了解它的组成 和配制方法。一、组成培养基的五类成分目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生 长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中， 氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将 硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。 钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高 的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的钠和氯化物，由

2、 钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、 钻和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4 与Na2EDTA螯合剂）的混合。碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培 养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是 蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压 也起重要作用。维生素在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维 生素属于B族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生 物素、泛酸钙和肌醇等。有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪肮水解物、酵 母提取物、椰子汁及各

3、种氨基酸等。另外，琼脂也是最常用的有机附 加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于 各种外植体的培养。生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：植物生长素类。如吲噪乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2, 4二氯苯 氧乙酸(2，4-D)。细胞分裂素。如玉米素(Zt)、6-苄基嘌吟(6-BA或BAP)和激动素 (Kt)。赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA3)。二、常用培养基配方及其特点常用培养基配方组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。不同 培养基有不同特点，适合于不同的植物种类和接种材料。开展组织培 养活动时，应对各种培养基进行了解和分

4、析，以便能从中选择使用。 下面介绍组织培养几种常用培养基的配方见表9 1。培养基中的激素种类和数量，随着不同培养阶段和不同材料而有 变化，因此各配方中均不列入。几种常用培养基的特点MS培养基。MS培养基是目前普遍使用的培养基。它有较高的无 机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十 分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒等过程中， 即使有些成分略有出入，也不致影响离子间的平衡。MS固体培养基 可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体 培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。这种培养基中的无机养 分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和

5、生理上的需 要。因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提 取物及椰子汁等有机附加成分。与其它培养基的基本成分相比，MS 培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。B5培养基。B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为 铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。经过试验发现，有些植物的 愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上要好， 而另一些植物，在B5培养基上更适宜。N6培养基。N6培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培 养，在国内外得到广泛应用。在组织培养中，经常采用的还有怀特 (While，1963)培养基、尼许(Nitsch，1951 )培养基等。它

6、们在基本成 分上大同小异。怀特培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植 物的组织培养。三、培养液的配制制备母液为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该 将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成 浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量 的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各 类物质制备母液的方法说明如下。大量元素。大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。制 备时，按表中排列的顺序，以其10倍的用量，分别称出并进行溶解， 以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1升，此即大量 元素母液。微

7、量元素。因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100 倍或1000倍的母液。配制时，每种化合物的量加大100倍或1000 倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。铁盐。铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO47H2O)5.57克和乙 二胺四乙酸二钠(NaEDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培养 基，加铁盐5毫升。有机物质。主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量， 分别配成所需的浓度(0.11.0毫克/毫升)，用时按培养基配方中要求 的量分别加入。植物激素。最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓 度很低，一般为0.0110毫克/升。可按用量的100倍或1000倍配 制母液，

8、配制时要单个称量，分别贮藏。配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容 量瓶中，用12毫升0.1N(克当量浓度)氢氧化钠溶解，再加蒸馏水 稀释至所需浓度。配制细胞分裂素时，应先用少量0.5或1N的盐酸 溶解，然后加蒸馏水至所需量。以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存， 以免变质、长霉。至于蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。配制培养基的具体操作根据配方要求，用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需 的用量，放入同一烧杯中，并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用。将中称好的琼脂加蒸馏水300400毫升，加热并不断搅 拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。将中所取

9、的各种物质（包括蔗糖），加入煮好的琼脂中，再 加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入中的培养基里，每次只滴 几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH 值调到5.8。将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶（或试管）中，并用棉塞 塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。 培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以 准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。 配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。成分单 的格式与内容见表9一2。培养基的灭菌与保存培养基配制完毕后，应立即灭菌

10、。培养基通常应在高压蒸汽灭菌 锅内，在汽相120C条件下，灭菌20分钟。如果没有高压蒸汽灭菌 锅，也可采用间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小 时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。经过灭菌的培养基应置于10C下保存，特别是含有生长调节物 质的培养基，在45C低温下保存要更好些。含吲噪乙酸或赤霉素 的培养基，要在配制后的一周内使用完，其它培养基最多也不应超过 一个月。在多数情况下，应在消毒后两周内用完。组培室设计规划之仪器设备配置篇在植物组织培养过程中，根据所培养的植物种类、生产规模，选 择合适的器材、设施是十分必要的，只有这样才能确保整个操作过程 的顺利

11、进行。在器材、设施的选择上，不要贪大求洋，应该在其是否 实用上多下功夫。在研究型的组织培养操作中，往往对器材、设施的 要求较高；而在生产型的组织培养中，则对器材、设施的要求却较为 粗放，因此管理者必须根据实际情况来进行培养器材、设施的遴选。 在植物组织培养的过程中，从外植体的采收到试管苗的定植都必须要 在特定的环境中进行，例如，培养基的配制要在专用的器材、设施中 进行；外植体的接种要在专用的器材、设施中进行。应该根据植物组 织培养不同阶段的需要，选择不同的器材、设施。只有从降低投入、 提高工效、节约劳力等诸方面加以考虑，才能降低培养成本、提高培 养效率。在植物组织培养过程中，所使用的器材种类较

12、多，但它 们通常可以分为通用器具、盛具、计量器械、灭菌器械、接种器械、 培养器械等几种类型。在使用这些容器、设备时，必须要了解它们的 基本用途，并学会它们的基本用法。例如，不能给容量瓶加热；必须 用磨砂玻璃灯罩来熄灭正在燃烧的酒精灯；应该定期更换超净工作如 的无菌滤膜等等。详细操作可参考具体设备、容器的使用说明。通用器械烧杯：用来盛放、溶解化学药剂等。常用的规格有50ml、100ml、 250ml、 500ml、 1000ml。烘箱：用来烘干器械。恒温水浴：用来溶解琼脂等物质。玻璃搅拌棒：用来配制培养基。洗耳球：用来辅助吸取、转移少量液体。冰箱：用来贮存化学药剂、植物材料等。牛角勺：用来转移化

13、学药剂。玻璃漏斗：用来过滤溶液。剪刀：用来修剪外植体或剪切嫩茎。器械架：在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。各种盛具搪瓷浅盘：用来承载各种器械容器。塑料盆：用于清洗培养容器。铁丝筐：用来盛放灭菌容器等物品。纯水水桶：用来存放去离子水或蒸馏水。常用的规格有10L、20L。塑料桶：用来存放洗涤溶液、废弃溶液。各种规格的磨砂玻璃瓶：用来盛放培养母液，以及各种植物生长物 质。计量器械量筒:用来量取一定体积的液体。常用的规格有25ml、50ml、100ml、 500ml、 1000ml。容量瓶：用来配制标准溶液。常用的规格有50ml、100ml、500ml、 1000ml。大肚移液管：用来吸取定量溶液。常

14、用的规格有1ml、5ml、10ml。刻度移液管:用来吸取定量植物生长物质溶液。常用的规格有1ml、 5ml、 10ml。移液管架：用来放置、固定移液管。酸度计：用来检测培养基的pH。药物天平：用来称取配制培养基的药品。分析天平：用来称取少量有化学试剂，进行化学分析。灭菌器械磨砂口玻璃瓶：用来对植物材料进行表面灭菌。酒精灯：用来进行接种器材的表面灭菌。细菌过滤器：用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液。无菌滤纸：用来汲取器材、植物材料表面的水分。无菌脱脂棉：用来进行器械、植物材料表面的灭菌处理。真空泵：用来吸滤灭菌。高压灭菌锅：对培养基、接种器材进行灭菌处理。可调试电炉：用来加热高压灭菌锅。皮下注射

15、器：用来对溶液进行过滤、除菌。紫外线灭菌灯：用来对接种室、培养室、操作室等工作环境进行灭 菌处理。接种器械超净工作台：用来过滤通过接种工作台面的空气，以便进行无菌操 作。小型喷雾器：装载灭菌药液，来给超净工作台等处喷雾灭菌。钝头镊子：在接种操作、继代培养时移取植物材料。尖头镊子：用来分离植物材料。解剖刀：用来切割植物材料。打孔器：用来切取大小一致的圆柱形植物材料。双目显微镜：在解剖较小的外植体时，用来观测材料。细菌滤膜：用来进行溶液的常温除菌。接种针：用来转移细胞团、愈伤组织。培养器械试管：用来作为外植体的培养容器。常用的规格有2cmX15cm、 3cmX15cm。培养皿:用来作为外植体的培养

16、容器。常用的规格有直径9cm、12cm。锥形瓶：即三角烧瓶，主要作为培养器材，常用的规格有50ml、 100ml。显微镜：用来观察植物材料。成套载玻片：用来制作植物材料显微制片。铝箔：用于培养容器封口。橡皮筋：用来束紧培养容器的封口材料。血球计数器：用来进行植物细胞计数。空调：用来调节操作间、培养室的温度。摇床：用来进行细胞悬浮培养。MS 培养基 MS Medium用途：用于植物组织培养的基础培养基配方：(g/L)成分分子量使用浓度(mg/L)P 日.主. 大量兀系硝酸钾 KNO3101.111900硝酸铵 NH4NO380.041650磷酸二氢钾 KH2PO4136.09170硫酸镁 MgS

17、O4.7H2O246.47370氯化钙 CaCl2.2H2O147.02440微量兀素碘化钾 KI166.010.83硼酸 H3BO361.836.2硫酸锰 MnSO4.4H2O223.0122.3硫酸锌 ZnSO4.7 H2O287.548.6钼酸钠 Na2MoO4.2H2O241.950.25硫酸铜 CuSO4.5 H2O249.680.025MS培养基相关产品：我公司亦生产成分不同含量的MS培养基，主要有：1/2MS培养基，1/4MS培养基，MS培养基（不含琼脂/不含琼脂 和蔗糖/不含有机元素、不含琼脂和蔗糖）等各种类型。如果有特 殊需要可按需定制培养基。B5培养基B5 Medium用途

18、：用于植物组织培养配方：（皿）1.无机物(mg/L):磷酸二氢150(NaH2PO4H2O)113.24无水氯化钙2500硝酸钾134硫酸铵122.09无水硫酸镁37.3乙二胺四乙酸二钠27.8硫酸亚铁10.0(FeSO47H2O)2.0硫酸锰3.0(MnSO42H2O)0.25硫酸锌0.025(ZnSO47H2O)0.025硼酸0.75钼酸钠(Na2MoSO42H2O)10.0硫酸铜1.0(CuSO45H2O)1.0氯化钻100.0(CoCl26H2O)20000碘化钾70002.有机物(mg/L):25 C维生素B1（盐酸硫胺素） 维生素B6（盐酸毗哆醇）烟酸 肌醇蔗糖琼脂pH 值 5.5 产品用法:称取本品30.21g，加热溶解于1000ml蒸馏水中,116C高压灭 菌30分钟备用。注意:如果pH值偏高，请用稀盐酸调整pH值至5.5。产品说明:B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少 培养物的生长有抑制作用。经过试验发现，有些