人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法） 项目立项报告

1、 版本：1.0 第 页项目立项报告项目名称：人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）项目编号：2018-001起草人/日期： 审核人/日期： 批准人/日期： XXXX医疗科技有限公司二年月日制立项依据【基因简介】 EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。【常见突变】 EGFR的突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显子上（1821），目前发现的TK

2、区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。发生在外显子20上的替代突变T790M为耐药突变，研究还发现L858Q、D761Y、T854A等耐药突变。【EGFR基因突变和EGFR-TKI敏感性】 EGFR-KTI的有效性也因突变类型而不同，外显子19缺失突变的有效率为81%，L858R的有效率为71%，G719X的有效率为56%。吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在19外显子缺失或L858R点突变等的敏感突变的基础上，又发生了第790位密

3、码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。研究发现有约13%的患者在TKI治疗前即存在T790M，即原发耐药，这种情况下TKI治疗难以有效。【检测样本类型】 经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌肿瘤组织。血浆。【临床意义】 （1）预测药物疗效：EGFR是HER/ErbB家族信号通路的首要分子，吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI进入细胞内，直接作用于EGFR胞内的激酶区，干扰ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻断激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化，彻底阻断异常的酪氨酸激酶信号传导，从而阻止配体介导的受体及下游信号通路的激活，阻滞细胞在G1期，促进凋亡，抑制新生血管形成、侵袭和转移，达到治疗的

4、作用。小分子TKI的疗效与EGFR基因突变密切相关，是TKI疗效预测因子。（2）预后评价：根据是否使用EGFR-TKI对肺癌切除后患者进行预后分析，EGFR敏感性突变并服用TKI的患者至少在单因素分析中有预后良好的趋势。但是，EGFR基因突变与女性、非吸烟者等这些传统的预后良好因子有交叉，只分析基因突变进行预后评价几乎是不可能的。【用药建议】（1）吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂的疗效与EGFR基因发突变密切相关，特别是当第19外显子缺失、第21外显子突变（L858R）和第18外显子突变（G719X）的患者，使用吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI可获益。（2）约13%未经TKI治疗的N

5、SCLC患者第20外显子存在T790M突变，但经TKI治疗后超过50%后耐药的患者出现T790M突变阳性，导致TKI治疗失败。也有报道认为L747S、D76IY、T854A突变阳性时，患者也会对吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂耐药。【局限性】临床实践表明，并不是所有携有EGFR突变的NSCLC患者都对酪氨酸激酶抑制剂有效，EGFR-TKI的有效性因突变类型而不同，如对外显子19缺失突变的肿瘤患者有效率为81%， L858R的有效率为71%，G719X的有效率为56%，而有些患者发生第20外显子插入突变却对TKI无效。另外，约10%的EGFR野生型NSCLC患者对酪氨酸激酶抑制剂有效，

6、但其机制尚不明确。研究内容研究目标：EGFR基因突变，研究的位点为：研究方法及技术路线采用荧光PCR法进行研究。项目可行性分析现有技术基础全新项目，无基础。（二）研发可行性分析1. 人 ：需要生物学相关专业的研发人员，本科及以上，需要有荧光PCR相关的工作经验或在校期间参与了荧光PCR相关的研究课题，能进行引物探针设计、能独立进行荧光PCR实验。具备一定的统计学基础。至少2人。2. 机 ：需要实时荧光PCR仪一台、微量紫外分光光度计一台、荧光计一台、移液器若干、超净工作台一台、生物安全柜一台、瞬间离心机一台、涡旋仪一台、医用冷藏箱一台、医用冷冻箱一台、超低温冰箱一台。3. 料 ：主要原料包括引

7、物、探针、DNA聚合酶、参考品、质控品。引物探针：主要是自己设计，然后由专门的引物合成公司合成，著名的合成企业包括生工、英潍捷基；DNA聚合酶：市面上有许多品牌，易于获取，国产与进口的价格差异大，需要在研发工作中实际考察才能确定如何选择。参考品：本产品有国家参考品，一套31000元左右，但长期缺货，很难购买，需要提前考虑。公司需要自制参考品，主要思路是从临床样本中提取DNA，经过测序或数字PCR验证，确定突变频率后，作为企业参考品使用。对于罕见突变，可以考虑用PCR扩增产物经过基因工程技术加工，插入到质粒中，制成企业参考品。质控品：质控品考虑用PCR扩增产物经过基因工程技术加工，插入到质粒中。

8、4. 法 ：该产品属于3类体外诊断试剂，不能豁免临床，相关的行业标准包括YYT 1586-2018 肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）、YYT 1591-2017 人类EGFR基因突变检测试剂盒，相关的技术指导原则包括肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则、人表皮生长因子受体（EGFR）突变基因检测试剂（PCR法）注册技术审查指导原则。5. 环 ：整个研究过程宜在PCR实验室中进行，实验室的设计和管理可参考卫办医政发2010194号 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法，整个过程严格防止PCR扩增产物对后续实验的影响。研发过程中会用到种种需要在2-8、-205、

9、-70的条件下储存的物料。研发过程中会用到临床样本，需要考虑生物安全的问题。（三）费用可行性分析费用科目预算说明设备费/材料费/采购费用/人员费/基础设施费用/临床费用/注册费用/管理费/不可预见费用/总计/（四）进度可行性分析本产品属于本公司研发的第一个项目，承担着理清研发流程的任务，故不对项目进度进行要求。（五）生产能力可行性产品需要在十万级生产车间生产，质控品需要在万级车间生产。故需要建设和租用洁净厂房，投入较大。对生产人员的素质要求较高，至少应有大专及以上学历，能够熟悉操作移液器、紫外分光光度计等仪器设备。（六）生产工艺水平可行性本产品的生产过程包括引物探针溶解定量PCR反应液配制分装

10、质控品分装贴标签成品组装。无特别复杂的操作步骤。（七）供应商的供应能力可行性引物、探针、DNA聚合酶均有较多可选择的供应商，其中有许多大品牌，可以保证供应。国家参考品货源紧张，需要重点关注。企业参考品涉及到临床样本的收集，属于研发过程中的重点、难点！（八）产品生产环境产品需要在十万级生产车间生产，质控品需要在万级车间生产。市场调查与分析所开发产品的预期国内外市场需求状况；2018年3月，国家癌症中心发布了中国最新癌症数据，该数据汇总了全国449处癌症登记点的数据。中国癌症统计一般滞后3年，最新公布的是2014年的发病和死亡数据。根据统计数据显示：无论是从发病率还是死亡率来看，肺癌都高居榜首，发

11、病率和死亡率分别达到57.13/10万人、45.80/10万人。另外，癌症的发病率和死亡率也存在着性别差异。男性发病率最高的是肺癌，发病率高达74.31/10万人，而女性的肺癌发病率要比男性的小很多，约为39.08/10万人，这主要是由于男性吸烟者较多导致的。 无论从发病率还是死亡率来看，肺癌都高居榜首，成为严重威胁人们生命健康的恶性肿瘤。肺癌可分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）其中非小细胞肺癌占据肺癌的绝大部分，而非小细胞肺癌中又细分为腺癌、鳞癌和大细胞癌等多种。根据美国癌症协会统计，非小细胞肺癌最为常见；据研究表明非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%-85%，东亚非小细胞肺

12、癌患者突变类型中EGFR突变率最高，达40%-55%，其次是KRAS突变8%-10%、ALK重排3%-5%、ROS1重排2%-3%、RET重排1%-2%、HER2突变2%-3%等，对于敏感突变的NSCLC，小分子靶向药为一线治疗方案。根据上述统计数据计算可得，2014年我国新增肺癌患者达78万人左右,其中非小细胞肺癌患者约为64万人，EGFR突变引起的肺癌患者约为29万人。并且从肺癌发病率以及我国人口基数来看，我国每年新增肺癌患者人数并没有下降的趋势，保守计算2014年之后至少和2014年计算的数据相当。我国癌症发病率TOP10（发病人数/10万）：肺癌居首位序号类别发病率男性发病率女性发病率

13、1肺癌57.13肺癌74.31乳腺癌41.822乳腺癌41.82胃癌41.08肺癌39.083胃癌30.00肝癌38.37结直肠癌23.434结直肠癌27.08结直肠癌30.55甲状腺癌18.995肝癌26.67食管癌26.46胃癌18.366食管癌18.85前列腺癌9.80宫颈癌15.307甲状腺癌12.40膀胱癌8.65肝癌14.388宫颈癌7.46胰腺癌7.45食管癌10.859脑癌7.40脑癌6.83子宫癌9.6110胰腺癌6.74淋巴瘤6.75脑癌7.99所开发产品的预期使用范围和医生的期望；近年来，表皮生长因子受体一酪氨酸激酶抑制剂( epidermal growth factor

14、 receptor-tyrosine kinaseinhibitors，EGFR-TKIs)等靶向药物已经成为晚期非小细胞肺癌( NSCLC)重要的治疗方式之一。在EGFR基因突变的晚期NSCLC患者，系列国际国内多中心临床研究已证实EGFR靶向治疗能显著降低疾病进展或死亡风险、改善患者生活质量。而在EGFR基因未发生突变的肺癌患者中，临床研究证据提示不宜使用靶向药物。这些临床研究和系统分析均指出EGFR基因突变检测是晚期肺癌患者使用EGFR-TKIs治疗的先决条件。鉴于多种原因，临床实践中EGFR基因突变的肺癌组织受检率并不高，导致基于驱动基因变异靶点的个体化治疗策略难以实施。多项回顾性和前

15、瞻性研究表明，当肿瘤组织难以获取时，血液循环游离或肿瘤DNA(cf/ctDNA)检测是突变分析合适的替代选择。中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)在2015年2月已批准吉非替尼说明书更新，在推荐所有NSCLC患者的肿瘤组织都应进行EGFR基因突变检测基础上，如果肿瘤标本不可评估，则可使用从血液（血浆）标本中获得的ctDNA进行评估。美国国立综合癌症网络(NCCN)指南建议：腺癌、大细胞癌及组织学类型无法确定等NSCLC应进行EGFR基因突变检测；非吸烟、小活检标本或混合型组织学类型的鳞癌患者也可考虑进行EGFR基因突变检测；可采用多种方法进行检测。欧洲临床肿瘤协会(ESMO)指南建议：晚期

16、非鳞癌的NSCLC患者应进行EGFR突变检测；除了从不吸烟或者很少吸烟（每年15包）的鳞癌患者外，已确诊鳞癌患者不推荐进行EGFR基因突变检测。美国临床肿瘤学会(ASCO)于2014年签署了一项美国病理学家联合学会(CAP)国际肺癌研究协会(IASLC)分子病理学协会(AMP)关于肺癌患者选择治疗靶点分子检测的临床实践指南，该指南明确指出：所有肺腺癌或者混合腺癌成分的肺癌患者，不考虑性别、种族和吸烟情况的特征，均应进行EGFR检测。我国NSCLC患者EGFR基因突变检测专家共识指出：所有NSCLC患者，不限组织学类型，只要条件许可，均应尝试进行基于肿瘤组织的EGFR基因突变检测。2015年欧洲

17、肺癌大会(ELCC)上公布了一项全球10个国家562位肿瘤专家参与的关于晚期NSCLC患者EGFR基因突变检测和治疗策略选择的调查研究结果：19%的晚期NSCLC患者未进行EGFR基因突变检测，即使进行检测，仍有26%的欧洲患者在结果出来前就开始接受治疗。未进行检测最常见的主要原因是病理组织学类型的限制（如鳞癌）；其次是缺乏足够的肿瘤组织。检测周期过长亦是未行EGFR基因突变的另一原因。在部分检测中心，检测周期甚至可达数周。此外，部分患者肿瘤内EGFR基因突变的异质性使基于基因检测的靶向治疗决策变得更加困难。我国的EGFR基因检测在肺癌患者中的受检率相对偏低，张力等报道2012年我国肺癌EGF

18、R基因突变受检率为20% - 30%，明显低于发达国家或地区的水平。如何在我国提高EGFR等基因变异受检率是提升我国肺癌精准诊治的关键因素之一。我国的肺癌EGFR基因突变受检率低也是与临床组织获取受限、经济原因、医师与患者的精准诊治意识、药物昂贵及获得不易等多因素相关。针对临床实践中肿瘤组织检测的种种局限，探寻作为其补充或替代的其他生物标本进行EGFR基因突变检测具有重要临床意义，有助于提高临床患者的总体EGFR基因受检率。同类竞争产品分析；近年来，EGFR基因突变检测试剂盒发展迅速，目前已经取得医疗器械注册证的EGFR产品共有37个，检测方法覆盖Taqman-ARMS法、荧光PCR法、荧光原

19、位杂交法、测序法、荧光PCR-毛细管电泳法、流式荧光杂交法、多重荧光PCR法、可逆末端终止测序法、半导体测序法等等。市场竞争较为激烈。序号产品、企业及注册证号1人EGFR基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法) (苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 国食药监械(准)字2013第3400362号)2人EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法) (北京雅康博生物科技有限公司 国食药监械(准)字2012第3401300号)3人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法) (无锡锐奇基因生物科技有限公司 国食药监械(准)字2013第3401386号)4EGFR基因检测试剂盒（荧光原位杂交法）

20、(广州安必平医药科技有限公司 国食药监械(准)字2013第3402095号)5人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法) (武汉海吉力生物科技有限公司 国食药监械(准)字2014第3400973号)6EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法) (北京金菩嘉医疗科技有限公司 国械注准20143402225)7EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法) (北京金菩嘉医疗科技有限公司 国食药监械(准)字2010第3401083号)8EGFR基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法) (北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 国械注准20143402145)9EGFR基因突变检测试剂盒(测序法) (中山大

21、学达安基因股份有限公司 国械注准20153401069)10EGFR基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法) (广州和实生物技术有限公司 国械注准20163400766)11人EGFR基因突变检测试剂盒（Taqman-ARMS法） (苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 国械注准20173404445)12人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法） (无锡市申瑞生物制品有限公司 国械注准20163400093)13EGFR基因检测试剂盒（荧光原位杂交法） (广州安必平医药科技股份有限公司 国械注准20173400640)14人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法） (无锡锐奇基因生物

22、科技有限公司 国械注准20173401181)15人EGFR基因突变检测试剂盒（PCR荧光法） (上海透景生命科技有限公司 国械注准20153401994)16人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法） (武汉海吉力生物科技有限公司 国械注准20173404737)17EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法) (苏州工业园区为真生物医药科技有限公司 国械注准20153401032)18人类EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法） (厦门艾德生物医药科技股份有限公司 国械注准20143402001)19人类EGFR基因21种突变检测试剂盒(荧光PCR法) (厦门艾德生物医药科技有限公司

23、国食药监械(准)字2010第3401228号)20EGFR基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法) (北京金菩嘉医疗科技有限公司 国食药监械(准)字2011第3400107号)21人类EGFR基因突变检测试剂盒(流式荧光杂交法) (益善生物技术股份有限公司 国食药监械(准)字2013第3400981号)22人类EGFR基因突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法) (武汉友芝友医疗科技有限公司 国食药监械(准)字2014第3400123号)23EGFR基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法) (北京金菩嘉医疗科技有限公司 国械注准20143402193)24EGFR 基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电

24、泳法) (北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 国械注准20153401131)25人EGFR基因20种突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法） (北京华大吉比爱生物技术有限公司 国械注准20163400041)26EGFR基因扩增检测试剂盒(荧光原位杂交法) (益善生物技术股份有限公司 国械注准20153401883)27人EGFR基因18-21外显子突变检测试剂盒（荧光PCR法） (北京雅康博生物科技有限公司 国械注准20163401512)28人类EGFR基因突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法） (武汉友芝友医疗科技股份有限公司 国械注准20173401245)29人类EGFR/ALK/ROS1

25、基因突变联合检测试剂盒（荧光PCR法） (厦门艾德生物医药科技有限公司 国械注准20163400037)30人EGFR基因突变检测试剂盒（PCR荧光探针法） (上海源奇生物医药科技有限公司 国械注准20163402146)31人类EGFR基因突变检测试剂盒（流式荧光杂交法） (益善生物技术股份有限公司 国械注准20173404066)32人类EGFR突变基因检测试剂盒（多重荧光PCR法） (厦门艾德生物医药科技股份有限公司 国械注准20183400014)33人EGFR基因突变检测试剂盒(PCR荧光探针法)(商品名：吉菲源) (上海源奇生物医药科技有限公司 国食药监械(准)字2012第3400

26、958号)34EGFR/ALK/ROS1/BRAF/KRAS/HER2基因突变检测试剂盒（可逆末端终止测序法） (南京世和医疗器械有限公司 国械注准20183400408)35人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法） (天津诺禾致源生物信息科技有限公司 国械注准20183400294)36人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法） (广州燃石医学检验所有限公司 国械注准20183400286)技术调查与分析2015年欧洲肺癌大会(ELCC)上公布了一项全球10个国家562位肿瘤专家参与的关于晚期NS

27、CLC患者EGFR基因突变检测和治疗策略选择的调查研究结果：19%的晚期NSCLC患者未进行EGFR基因突变检测，即使进行检测，仍有26%的欧洲患者在结果出来前就开始接受治疗。未进行检测最常见的主要原因是病理组织学类型的限制（如鳞癌）；其次是缺乏足够的肿瘤组织。检测周期过长亦是未行EGFR基因突变的另一原因。在部分检测中心，检测周期甚至可达数周。此外，部分患者肿瘤内EGFR基因突变的异质性使基于基因检测的靶向治疗决策变得更加困难。我国的EGFR基因检测在肺癌患者中的受检率相对偏低，张力等报道2012年我国肺癌EGFR基因突变受检率为20% - 30%，明显低于发达国家或地区的水平。如何在我国提高EGFR等基因变异受检率是提升我国肺癌精准诊治的关键因素之一。我国的肺癌EGFR基因突变受检率低也是与临床组织获取受限、经济原因、医师与患者的精准诊治意识、药物昂贵及获得不易等多因素相关。来自肿瘤部位