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文档简介

1、制药过程与工艺主讲教师:左振宇武汉科技大学 化学工程与技术学院 生物工程专业二零 年 十 月1课程介绍制药工艺学是研究药物的工业生产过程共性规律及其应用,包括制备原理、工艺路线、质量控制。制药工艺学是综合应用化学系列、生物系列、机械设备与工程单元操作等课程的专门知识,深化理解并掌握工艺原理,充分考虑药品的特殊性,针对生产条件、所需环境等的具体要求,研究药物制造原理、工艺路线与过程优化、中试放大、生产技术与质量控制,从而分析和解决生产过程的实际问题。从工业生产角度,改造、设计和开发药物的生产工艺,制定相应的操作规程。 制药工艺学课程的知识体系由三个知识领域、众多知识单元和知识点三个层次组成。第一

2、领域为生物技术制药工艺;第二领域为化学制药工艺;第三领域为制药工艺的共性基础。每个知识领域进一步分解成若干个知识单元,每个知识单元又包涵若干个知识点,最后形成的制药工艺学课程体系。2课程介绍课程内容第1章 导论第2章 微生物发酵制药工艺第3章 基因工程制药工艺第4章 动物细胞培养制药工艺第5章 化学药物工艺路线的设计和选择第6章 合成药物工艺研究第7章 典型化学制药工艺 第8章 手性药物合成第9章 中试放大与生产工艺规程 共30学时,讲授28学时,答疑2学时考核方法理论考试占80%;平时占20%3课程介绍参考书元英进. 现代制药工艺学,化学工业出版社,2004年齐香君. 生物制药工艺学,化学工

3、业出版社,2003年Heinrich Klefenz. Industrial Pharmaceutical Biotechnology. Wiley-VCH, 20024第一章 绪论5本章内容1.1 制药工艺学课程地位和性质1.2 天然提取制药技术发展1.3 生物技术制药发展1.4 化学合成制药技术发展1.5 制药工业的发展1.6 制药技术展望61.1 制药工艺学课程地位和性质7一 课程性质和地位制药业发展与挑战90年1752亿USD00年4775亿USD增长大于8%全球4496亿元,年增长大于12 制药业集中度 原料药生产大国制药技术和装备整体水平低中国8国外制药工程教育1995年,NSF

4、新泽西州立大学Rutgers分校制药工程研究生教育密西根大学等高校也相继设立制药工程专业:The California State University, Fullerton ; New Jersey Institute of Technology; Columbia University, New York; Ecole Polytechnique of Montreal; The University of Leeds; University of Pennsylvania; University of Alabama除美国外,加拿大、英国和德国、日本和印度等国家的部分高校也已设立制药工程

5、教育计划。9国内制药工程教育1998年中国教育部调整新设置制药工程工科本科专业化学制药生物制药中药制药制药工程10制药工程制药工艺学、制药分离工程、药品质量管理工程、制药设备等厚基础,宽口径,注重培养全面素质与创新能力制药过程共性规律、技术、学科基础、发展需求化学制药生物制药微生物制药中药制药工业制剂生物化工制药工程专业与原专业的关系11二 研究对象与内容制药工艺:从发现-药物上市发现临床前临床毒理注册生产GLPGCPGMP化学化学生物生物中药剂型开发过程开发工业制药工业制药技术开发技术开发GLP药物非临床研究质量管理规范GCP 药物临床试验质量管理规范GMP 药品生产质量管理规范121 研究

6、对象药物生产过程共性规律及其应用,包括 制备原理+工艺路线+质量控制重要性: “安全、有效、均匀、可控”的保证 药物产业化的桥梁与瓶颈 贯穿整个药物研发过程132 主要内容综合应用化学系列、生物系列、机械设备与工程单元操作等课程的专门知识深化理解并掌握工艺原理,去分析和解决研发和生产过程的实际问题。从工业生产角度,改造、设计和开发药物的生产工艺,制定相应的操作规程。14主要内容实验室(小试)工艺中试放大工艺在车间生产若干批号后,制定生产工艺规程15制药工艺的类别(药物分类)化学合成药物(synthetic drug)布洛芬、雷尼替丁、氧氟沙星生物合成药物(biosynthetic drug)重

7、组人胰岛素、重组人红细胞生成素中药(traditional chinese medicine)速效救心丸、复方丹参滴丸16按照典型药物生产过程,分为4类:化学制药工艺学生物制药工艺学中药制药工艺学制剂工艺学171.2 天然提取制药技术发展18天然提取制药是指直接从天然材料中使用分离纯化等技术制备药物。现代药物最初来源于植物、动物和微生物,而且以提取分离为先导。 19发展历史1517世纪,欧洲有了金鸡纳、愈创木、药喇叭根、古柯果和可可等。 19世纪,掀起了天然提取分离药物的热潮,从植物中分离出纯的有效化学物质。从鸦片中提取出吗啡结晶;从吐根中分离得活性成份吐根碱。从金鸡纳树皮分离得到了奎宁,成为

8、最早用于治疗疟疾的药物。从莨菪中提取了阿托品,从古柯叶取得了可卡因;从洋地黄叶子获得洋地黄甙晶体。20世纪50年代后,对动物脏器的有效成分和生理活性物质的全面了解,生产技术提高,改变了原来的混合制剂,生产单一特异性组分的生化药物制剂。如猪牛胰岛素、前列腺酶及辅酶、激素、脂类、蛋白质和核酸及其降解产物等。生化药物品种迅速增加,已成为一类重要的药物。 20由于合成工艺、技术等因素的限制,仍然有些氨基酸、维生素、核苷酸、酶、多糖、脂类等仍然不能合成生产,必须直接从天然材料中提取。还有一些手性药物和半合成药物的中间原料也必须从天然材料中直接提取。211.3 生物技术制药发展22一 相关定义生物技术药物

9、(biotechnology medicine)是利用生物机体、组织、细胞,生产制造或从中分离得到的具有预防、治疗和诊断功能的药品,包括多肽、蛋白质、酶和核酸以及具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。生物技术药物(biotechnology medicine)、生物技术产品(biotechnology product)、生物技术制品(product of pharmaceutical biotechnology)有时候也互换使用。在相关法规中,经常出现的术语是生物制品 (biologics,biologic product, 中国、美国使用)、生物医药产品(biolo

10、gical medicinal product,欧盟使用)。 23中国生物制品规程对生物制品的定义:以微生物、寄生虫、动物毒素、生物组织为起始材料,采用生物学工艺或分离纯化技术制备,并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂,包括菌苗、疫苗、毒素、类毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、抗体、变态反应原、细胞因子、激素、酶、发酵产品、单克隆抗体、DNA重组产品和体外免疫诊断制品等。分为预防用生物制品、治疗用生物制品和诊断用品三类。预防用生物制品包括疫苗、菌苗和类毒素;治疗用生物制品包括抗血清与抗毒素、血液制品、细胞因子与抗体;诊断用品包括细菌学试剂、免疫试剂、临床化

11、学试剂。 24二 生物制药的类型微生物发酵制药采用微生物发酵生产药物。第二次世界大战期间诞生了以抗生素为代表的次级代谢产物的工业发酵,很快应用到其他药物的发酵生产,如氨基酸、维生素、甾体激素等。微生物药物主要为抗生素(antibiotic)、氨基酸(amino acid)、维生素(vitamin)、核苷酸和核苷 (nucleotide, nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制剂(enzyme inhibitor)、免疫调节剂(immunomodulator)和受体拮抗剂(receptor antagonist)等。 酶工程技术制药酶工程技术在制药工业上的主要应用是(1)生物酶用于制

12、备手性药物;(2)生物转化,给已有药物添加基团,增加药效和功能 。 25细胞培养技术制药动植物细胞培养(cell culture)是在离体条件下人工培养基上培养动植物细胞,使之生长繁殖并发育。主要应用于生产人畜病毒疫苗、单克隆抗体、重组基因工程产品等。 基因工程技术制药基因工程(gene engineering)制药是在体外通过重组DNA技术,对生物的遗传物质基因进行剪切、拼接、重新组合,与适宜的载体连接,构成完整的基因表达系统,然后导入宿主生物细胞内,与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖,并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。 通过基因工程改造微生物细胞的代谢过程,还可提高抗生素、维

13、生素、氨基酸、核酸、辅酶、甾体激素等药物的生产能力。 26三、生物药物的用途1 作为治疗药物按药理作用主要有以下:内分泌障碍治疗剂:胰岛素、生长素、甲状腺素等。维生素类药物:主要起营养作用,用于维生素缺乏症。中枢神经系统药物:L多巴,人工牛黄、脑啡肽。血液及造血系统药物:常见的有抗贫血药(血红素)、抗凝药(肝素)、纤溶剂抗血栓药(尿激酶)等。呼吸系统药物:平喘药(PGE、肾上腺素)、祛痰剂(乙酰半胱氨酸)、镇咳药(蛇胆、鸡胆)。心血管系统药物:抗高血压药(激肽释放酶)、降血脂药(弹性蛋白酶,猪去氧胆酸)、冠心病防治药(硫酸软骨素A)27消化系统药物:助消化药(多酶片)、溃疡抑制剂(胃膜素、维生

14、素U)、止泻药(鞣酸蛋白)。抗病毒药物:抑制病毒核酸的合成,如碘苷抑制病毒合成酶,如阿糖腺苷调节免疫功能,如干扰素抗肿瘤药物:主要有核酸类抗代谢物(阿糖胞苷,5-氟尿嘧啶)、抗癌天然大分子(天冬酰胺酶,香菇多糖PSK,灰树花多糖)、提高免疫力抗癌剂(白介素2,干扰素)抗辐射药物:如超氧歧化酶(SOD)计划生育用药:口服避孕药(复方炔诺酮)生物制品类治疗药: 各种免疫蛋白、抗毒素、抗血清(蛇毒抗血清)。282 作为预防药物常见的预防药物有菌苗、疫苗、类毒素及冠心病防治药物。3 作为诊断药物(1)免疫诊断试剂利用高度特异性和敏感性的抗原机体反应,检测样品中有无相应的抗原或抗体,可作为临床诊断的依据

15、。主要有诊断抗原和诊断血清。诊断抗原:细菌类,如伤寒病毒类,如SARS,乙肝病毒毒素类,如链球菌溶血素O29 诊断血清:细菌类病毒类肿瘤类抗毒素类激素类血型及人类白细胞抗原诊断血清其它(2)酶诊断试剂利用酶反应的专一性和快速灵敏的特点,定量测定体液内的某一成分变化作为病情诊断的参考。 目前有40余种酶诊断试剂盒。30(3)器官功能诊断药物利用某些药物对器官功能的刺激作用,排泄速度等已检查器官的功能损害程度。如甘露醇等。(4)放射性核素诊断药物放射性核素诊断药物有聚集于不同组织或器官的特性,故加入体内后,可检测其在体内的吸收、分布、转运、利用及排泄等情况,从而显示器官功能及其形态,以供疾病的诊断

16、。(5)诊断用单克隆抗体(McAb)McAb的特点之一是专一性强,一个B细胞所产生的抗体只针对抗原分子上的一个特定抗原决定族。31(四)用作其它生物医药用品生化试剂 如细胞培养基、电泳试剂等生物医学材料 手术缝合线、人造骨头等。营养保健品和美容化妆品321.4 化学合成制药技术发展33全合成制药磺胺嘧啶、阿司匹林半合成制药 多烯紫杉醇、头孢类抗生素手性制药 阿托伐他汀、阿奇霉素34化学制药工艺的要求最安全:易燃易爆、有毒的原料与中间体最经济:成本最低最便捷:工艺路线最短,最简,易于组织生产绿色工艺:三废,废水、气、渣351.5 制药工业的发展36一 全球制药工业的发展 制药工业(pharmac

17、eutical industry)的历史大约70多年,但一开始就发展很快,目前全世界制药企业超过10000家,生产制造5000多种药物,其中约100家为跨国公司。20世纪初所用药物只有四种:洋地黄用于治疗各种心血管疾病,奎宁用于治疗疟疾,吐根属植物提取物(活性成分为生物碱)用于治疗痢疾,水银用于治疗梅毒,但当时缺乏安全性和有效性。 20世纪70年代以后,出现现代生物技术制药公司。目前,全世界生物技术公司4400多家,主要集中在欧美,美国1444家,欧洲1815家,加拿大472家,亚太地区685家。年产值超过10亿美元的生物技术公司有20余家。 37世界制药行业具有以下特征并购风云不断,重组形成

18、更大集团,强强联合优势互补,战略性驱动,企业经营的专业化,企业间的合作。并购数量增加,药品生产的集中度不断提高。研发费用持续上升,投入继续增大,国际10大制药公司的年均投入占销售额的16左右。1个新药的研发费用约810亿美元,但新药批准上市的数目在下降。研发的难度越来越大,新产品是行业的希望。重磅炸弹药物数目持续增加,从1995年到2004年,增长了近4倍。跨国公司更多依赖于重磅炸弹药物,是企业的主要利润来源。生物技术药物异军突起。20世纪80年代以前是治疗性药物,20世纪90年代是改善生命质量的药物,而进入21世纪,将是靶向的蛋白质、多肽和核酸类治疗性药物。 38二 我国制药工业发展 中国制

19、药工业的发展经历了从药店到厂房,再到现代化企业和集团的过程。20世纪2030年代,上海、广州是我国近代制药工业的发祥地,但制药工业十分落后。1949年新中国成立初期,重视医药工业的发展,确定了“以发展原料药为主”的方针。同时,积极发展药物制剂生产。1951年试制出第一批结晶青霉素,1958年,以生产抗生素为主的华北制药厂建成投产;至1959年,中国建立起化学制药工业。 20世纪80年代后,走上了按正规制药工业管理和发展的道路。 391.6 制药技术展望40制药行业是一个集约化、国际化程度极高的产业。国外公司在中国设立研发机构,并把生产制造中心向中国转移。“十一五”时期乃至更长时间我国医药市场需

20、求将继续保持旺盛势头。中国医药市场今后5年内将以1520的速度发展,到2010年将达到240亿美元,成为继美国、日本、德国和法国之后的世界第5大医药市场,2020年将达到1200亿美元,超过美国成为全球第一大市场。从制药业各子行业看,未来510年期间,我国医药市场将继续保持以化学药为主,生物技术制药已经成为制药行业的新领域,天然提取制药有很大发展空间。 主要途径为:创新药物研究、抗体工程制药技术、制药工艺新技术及其改造。41创新药物研究 加大制药的科研开发投入,研究并拥有自主知识产权的药物和技术。我国现有常用西药4 000多种,其中97属于仿制国外产品或进口药。采用组合生物化学、生物分子芯片、

21、细胞组织和动物模型等高通量的方法筛选天然药物,发现新型治疗药物。利用人类基因组和蛋白质组以及病原生物体的基因组的最新成果,计算机技术,把生物信息学、分子生物学、基础医药学、药物化学、药理学等的技术综合起来,通过突变、生物展示、嵌合、质谱分析等,进行新型药物的辅助设计和药物筛选,获得创新性药物。 通过基因工程技术,改变重组蛋白类药物的结构,从而增强活性,延长体内的半衰期。 利用生物分子修饰化学药物。如利用人白蛋白制成的纳米颗粒结合紫杉醇注射制剂,代替传统的紫杉醇制剂可避免过敏反应,加强了紫杉醇的临床效果和安全性。42抗体工程制药技术 FDA批准上市的生物药物中,抗体类药物所占比例越来越大,200

22、4 年有11 个,3个为全新药物,其它为新适应症。抗体类药物一上市就成为年销售额逾亿美元的重磅炸弹药 (blockbuster drug)。基于单克隆抗体的治疗剂主要的应用领域是癌症,上市的抗体药物一半都在营利。预计单抗药物的全球销售额将从2004年的50多亿美元增至2010年的150亿美元,平均年增长30%。 43制药工艺新技术及其改造 应用现代科学技术改造我国传统的医药工业,使我国制药行业的经济实现由速度型向效益型、由粗放型向集约型的根本转变,用先进的制造技术进行药物生产。研究适用于大规模药物生产的动植物和微生物表达系统,提高药物生产效率的新途径。大力开发手性药物及外消旋药物的手性转化。加

23、强环境保护与质量意识。 44本章结束45第2章 微生物发酵制药工艺46本章内容2.1 微生物发酵与制药2.2 制药微生物生长与生产关系2.3 制药微生物菌种的建立2.4 培养基制备2.5 灭菌工艺2.6 微生物发酵培养技术2.7 发酵工艺过程的控制2.8 抗生素生产工艺2.9 氨基酸发酵生产工艺2.10 维生素生产工艺472.1 微生物发酵与制药48一 发酵概念发酵概念:通过微生物培养而获得产物的过程。发酵种类:用产品说明,冠以产物名而成,如青霉素发酵,维生素发酵;发酵工程按需氧分为好氧发酵和厌氧发酵。 初级代谢产物:在初级代谢过程中形成的产物,包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核

24、酸等。生长所必须的。几乎所有生物初级代谢基本相同。氨基酸,核苷酸,有机酸。次级代谢产物:比较复杂的化合物,不是细胞生长必需的,对生命活动有意义(抗逆境条件)。抗生素,毒素,色素。49发酵制药种类微生物菌体发酵微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的,如:面包的酵母发酵、单细胞蛋白发酵(利用各种碳源)、真菌类(各种蘑菇、冬虫夏草)、生物防治剂(苏云金杆菌,伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫)。微生物酶发酵微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵,如青霉素酰化酶,用于半合成青霉素时,制备中间体6氨基青霉烷酸。微生物代谢产物发酵初级代谢产物:氨基酸,核苷酸,维生素,有机酸。次级代谢产物:最主要的是抗生素。微

25、生物转化发酵利用微生物的一种或多种酶把一种化合物转变为结构相关的更有价值的产物的生化反应为转化发酵。 50制药微生物的种类 生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素,如芽孢杆菌(Bacillus)产生杆菌肽(bacitracin),多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)产生黏菌肽(colistin)和多黏菌素(polymyxin)。细菌还可以产生氨基酸和维生素,如黄色短杆菌(Brevibacterium flarum)产生谷氨酸,大小菌生产维生素C。放线菌主要产生各类抗生素,以链霉菌属最多,诺卡菌属较少,还有小单孢菌属。生产的抗生

26、素主要有氨基糖苷类(链霉素、新霉素、卡那霉素等)、四环类(四环素、金霉素、土霉素等)、放线菌素类(放线菌素D)大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素)和多烯大环内酯类(制霉菌素、抗滴虫霉素等)。酸性、碱性和中性,但以碱性为多。真菌的曲菌属产生桔霉素,青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等,头孢菌属产生头孢霉素等。脂环芳香类或简单的氧杂环类,多为酸性化合物。 51发酵制药的基本过程 菌种选育发酵工段提炼工段成品工段孢子制备种子制备发酵控制预处理分离提取浓缩纯化成品工段包装原料药实验室、种子库发酵车间提炼车间包装车间522.3 制药微生物菌种的建立53新药生产菌的选育 自然分离 自然选育 诱变育种 杂

27、交育种 基因工程技术育种 基因组shuffling技术 542.8 抗生素生产工艺以青霉素为例55一 概述发现1929: Fleming在葡萄球菌培养皿中,污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。杀菌物质,断言太不稳定,无法分离并用作药物。1939:牛津病理家Howard Florey化学家Ernst Chain,Norman Heatley。发酵瓶培养霉菌,培养里提取,测活性,青霉素结晶。56发展1940:8只鼠注射链球菌,提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡,治疗鼠存活数天至数周。1941年2月开始治疗第一批人类病人。1943:威斯康辛大学小组,取得突破生产菌表面培养:几十个单位。深层培养

28、产黄青霉:100U/ml。X、UV诱变育种:10001500U/ml。不产色素变种:6600070000U/ml目前:85000U/ml。57概述作用机理细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合,使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效,静止细胞无效高效、安全的抗细菌感染药物58概述应用临床抗感染治疗:大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小,但需要皮试。各种半合成抗生素的原料:氨苄青霉素,磺苄青霉素,乙氧萘青霉素头孢菌素母核。59二 青霉素生产菌的生物学特性 产黄青霉:Penicillium chrosogenum

29、孢子:绿色和黄色菌落:平坦或皱褶,圆形。青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝:球状和丝状两种。60发酵条件下的生长过程 第1期:分生孢子萌发,形成芽管,原生质未分化,具有小泡。第2期:菌丝繁殖,原生质体具有嗜碱性,类脂肪小颗粒。第3期:形成脂肪包涵体,机理贮藏物,没有空泡,嗜碱性很强。第4期:脂肪包涵体形成小滴并减少,中小空泡,原生质体嗜碱性减弱,开始产生抗生素。第5期:形成大空泡,有中性染色大颗粒,菌丝呈桶状,脂肪包涵体消失,青霉素产量最高。第6期:出现个别自溶细胞,细胞内无颗粒,仍然桶状。释放游离氨,pH上升。第7期:菌丝完全自溶,仅有空细胞壁。 61镜检规定时间取样,显微镜观察7个时期的形态

30、变化,控制发酵。14期为菌丝生长期,3期的菌体适宜为种子。45期为生产期,生产能力最强,通过工程措施,延长此期,获得高产。在第六期到来之前结束发酵。 62三 发酵工艺过程631 生产孢子制备工斜面种子:砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养。米孢子:移植到小米或大米固体培养基上,生长7天,25。注意:每批孢子必需进行严格摇瓶试验,测定效价及杂菌情况。642 种子罐培养工艺一级种子发酵:发芽罐,孢子萌发,形成菌丝。培养基:葡萄糖,玉米浆,碳酸钙,玉米油,消沫剂等。空气流量1:3(体积比);300-350rpm;pH自然,温度271, 40h二级种子罐:繁殖罐,大量繁殖。接种量10

31、培养基:葡萄糖、玉米浆,玉米油,消沫剂等。1:1-1.5;250-280rpm;pH自然,251。10-14h质量:菌丝致密,菌丝粗壮,III期,倍增期6-8h653 生产罐培养工艺三级罐:生产罐;接种量20。培养基:花生饼粉,葡萄糖,尿素,硝酸铵,硫代硫酸钠,苯乙酰胺,CaCO3, 玉米油, 硅油。参数条件:通气量1:0.8-1.2;150-200r/min;前60小时:pH6.4-6.6,26;60小时后: pH6.7, 24。664 发酵培养与过程控制操作方式:反复分批式发酵。发酵罐:100M3,装料80M3。带放: 6-10次,带放量10,间隔24h。发酵周期:180-220h。67(

32、1)过程控制补料分批操作控制基质浓度前40小时:培养基中的主要营养物40小时后:低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等,维持一定的最适浓度。半饥饿状态:延长合成期,提高产量。碳源占成本12以上,采用糖化液流加,降低成本。糖与6APA结合形成糖基-6APA,影响青霉素产量。68流加碳源控制根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。葡萄糖的波动范围较窄,浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止,过高则导致呼吸活性下降,甚至引起自溶。残糖0.3-0.6左右,pH开始升高时流加糖。浓度:500kg/m3,流速:1.0-2.5kg/m3h。69流加氮源控制玉米浆: 最好,含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。补加无

33、机氮源:硫酸铵、氨水、尿素。氨基氮浓度:0.01-0.05%。70盐离子控制无机盐:硫、磷、镁、钾等。铁对青霉素合成有毒,30-40 ug/ml以下。罐壁涂环氧树脂保护层。71(2)添加青霉素侧链前体时期:合成阶段。种类:苯乙酸及其衍生物,苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸。毒性:抑制细胞生长和青霉素合成。策略:低浓度流加。浓度:苯乙酸0.1%,苯乙酰胺0.05-0.08%。控制:保持供应速率略大于生物合成需要。72提高产量的其他物质流加表面活性剂:新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物:聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他:剪切保护剂;分散

34、剂73(3)温度控制适宜菌丝生长温度30,分泌青霉素20。20青霉素破坏少,周期很长。变温控制,不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度,缩短生长时间;生产阶段适当降低温度,以利于青霉素合成。前期控制26左右,后期降温控制24。74(4)pH控制合成适宜pH6.46.6左右,避免超过7.0直接加酸或碱:自动控制流加葡萄糖:恒速;变速,依赖pH变化快慢。pH下降:补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升:补加糖、生理酸性物质(硫酸铵、油脂)75(5)溶氧控制30饱和度,产率急剧下降;10,造成不可逆的损害。临界溶氧浓度:30。通气比:1:0.81.5 。适宜的搅拌速度:保证气液混合,提高溶氧。

35、调整搅拌转速:各阶段的生长和耗氧量不同。76(6)消沫天然油脂:玉米油;化学消沫剂:泡敌。策略:少量多次。注意:前期不宜多加入,影响呼吸代谢。77四 提炼工艺过程青霉素不稳定,遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定,非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂,水中溶解度很小青霉素盐很稳定;降解产物具有致敏性防止降解,条件温和、快速。781 预处理青霉素的存在部位:发酵液。浓度较低:1030kg/m3。含有大量杂质:菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等。目的:浓缩目的产物,去除大部分杂质,改变发酵液的流变学特征,利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白

36、。792 过滤鼓式真空过滤机过滤:一次滤液:pH6.2-7.2,略浑,棕黄或绿色,蛋白质含量0. 5-2.0%。板框式过滤机过滤:硫酸调节pH4.5-5.0,加入0.07%溴代十五烷吡啶,0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液:澄清透明,用于提取(收率90)803、溶剂萃取原理:青霉素游离酸易溶于有机溶剂,而霉素盐易溶于水。萃取剂:青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用:醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质:加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取:23次。81逆流萃取过程正相萃取:酸化pH1.8-2.0,滤液:醋酸丁酯1:0.3,碟片式离心机分离(浓缩1.5-2.1)反相萃取:pH6.8-7.4(磷酸

37、盐、碳酸盐缓冲液)。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取23次,达到结晶要求。萃取条件:10下。萃取罐冷冻盐水冷却。824 脱色萃取液中添加活性炭,除去色素。过滤,除去活性炭。835 结晶直接结晶加醋酸钠乙醇溶液反应:得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液:得到青霉素钾盐。845 结晶共沸蒸馏结晶萃取液,再用0.5 M NaOH萃取pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇,16-26,真空0.67-1.3KPa)下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥(60真空16h),磨粉,装桶,得到青霉素产品。852.9 氨基酸发酵生产工艺86一 氨基酸类药物得基本概

38、念氨基酸87氨基酸及其衍生物在医药中的应用氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系必需氨基酸人和哺乳动物自身不能合成,需要由食物供应,称为必需氨基酸。赖氨酸,色氨酸,苯丙氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸等8种。治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其盐酸盐,谷氨酰胺,乙酰谷酰胺铝,甘氨酸及其铝盐,硫酸甘氨酸铁,维生素U及组氨酸盐酸盐等。治疗肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸盐酸盐,磷葡精氨酸,鸟天氨酸,谷氨酸钠,蛋氨酸,乙酰蛋氨酸,瓜氨酸,赖氨酸盐酸盐,及天冬氨酸等。88治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸钙盐及镁盐,氢溴酸谷氨酸,色氨酸,5羟色氨酸、左旋多巴等。用于肿瘤治疗的氨

39、基酸及其衍生物偶氮丝氨酸,氯苯丙氨酸,磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其它氨基酸类药物的临床应用89二 氨基酸类药物的生产方法1 发酵法2 水解法3 酶法转化90L异亮氨酸的制备培养液灭菌灭菌培养液菌种培养接种发酵发酵液过滤上层液酸化滤液离子交换洗脱液减压蒸馏浓缩液活性炭脱色滤液减压浓缩浓缩液氨水中和沉淀水结晶干燥L异亮氨酸成品1 发酵法91工艺过程1)菌种培养种子培养基组成()为:葡萄糖2,尿素0.3,玉米浆2.5,豆饼水解液0.1,pH6.5。二级种子培养基加菜籽油,其余同一级种子培养基。一级种子培养:1000ml三角烧瓶中培养基装量为200ml,接种一环牛肉膏斜面AS1.998菌种,摇床

40、3016h。二级种子培养:接种量3.5,培养8h。逐级放大。2)灭菌、发酵发酵培养液组成():硫酸铵4.5,豆饼水解液0.4,玉米浆2.0,碳酸钙4.5,pH7.2,淀粉水解还原糖粗糖浓度11.5。灭菌,接种1菌种(v/v),搅拌,发酵。923)除菌体,酸化发酵结束后,发酵液加热至100并维持10min,冷却过滤,滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5,过滤除沉淀。4)离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5的流速进H型732离子交换柱(40 100cm), 以100L去离子水洗柱,再以60,0.5mol/L氨水按3L/min的流速进行洗脱。分部收集洗脱液。5)浓缩赶氨6)脱色、浓缩、中和7)

41、精制,烘干931 水解法(一)基本原理蛋白质水解方法酸水解法、碱水解法、酶水解法氨基酸分离方法溶解度法、特殊试剂沉淀法、吸附法、离子交换法氨基酸精制方法结晶,重结晶94L胱氨酸的制备:人发或猪毛水解液L半胱氨酸粗品滤液L半胱氨酸粗品滤液L半胱氨酸盐酸水解氢氧化钠中和盐酸,活性炭氢氧化钠中和盐酸,活性炭中和,氨水水解法举例95延胡索酸NH3固定化天冬氨酸酶转化转化液LAsp粗品分离L-Asp精品转化液固定化LAsp脱羧酶浓缩结晶LAla粗品LAla精品精制3 酶法转化天冬氨酸和丙氨酸的制备96工艺过程1)菌种培养大肠杆菌(E. coli) AS 1.881 的培养斜面培养基为普通肉汁培养基摇瓶培

42、养基成分():玉米浆7.5,反丁烯二酸2.0,硫酸镁(7水)0.02,氨水调pH6.0,煮沸后过滤,500ml三角烧瓶中装液量50-100ml。从新鲜斜面上或液体中培养种子,接种子于摇瓶培养基中,37振摇培养24h,逐级扩大培养至10002000ml规模。培养结束后用1mol/L HCl调pH5.0,升温至45并保温1h,冷却至室温,离心收集菌体。德阿昆哈假单胞(Pseudomonas dacunhae)68变异株的培养斜面培养基组成()为蛋白胨0.25,牛肉膏0.52,酵母膏0.25,NaCl0.5,pH7.0,琼脂2.0。种子培养基与斜面培养基,不加琼脂,250ml三角烧瓶中培养基装量40

43、ml。摇瓶培养基组成()为L谷氨酸3.0,蛋白胨,酪蛋白水解液0.5,磷酸二氢钾0.05,MgSO4.7H2O 0.01,用氨水调pH7.2,500ml三角烧瓶中培养基装量为80ml。将培养24h的新鲜斜面菌种接种于种子培养基中,30振摇培养8h,再接种于摇瓶培养基中, 30振摇培养24h,逐级放大。972)细胞固定化E coli的细胞固定化取湿菌体20kg,悬浮于生理盐水中,保温至40,再加入90L保温至40的12明胶溶液及10L1.0戊二醛溶液,充分搅拌均匀,放置冷却凝固,再浸入0.25戊二醛溶液中。于5过夜后,切成35mm的立体小方块,浸入0.25戊二醛溶液5过夜,蒸馏水充分洗涤,滤干得

44、含天冬氨酸酶得固定化。假单胞菌体固定取湿菌体20kg,加生理盐水搅拌至稀释至40L,另取溶于生理盐水的5角叉菜胶溶液85L,两液均保温至45后混合,冷却至5成胶。浸于600L2KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/L pH7.0的磷酸缓冲液中,5下搅拌10min,加戊二醛至0.6mol/L浓度, 5搅拌30min,取出切成35mm的立体方块,用2KCl溶液充分洗涤后,滤去洗涤液,即得固定化脱羧细胞。983)生物反应堆的制备4)转化反应5)产品纯化与精制99L脯氨酸4 化学合成法100L谷氨酸乙醇硫酸三乙胺L谷氨酸乙酯KBH4还原LPro反应液五氯酚沉淀氨水解析滤液活性炭滤液乙醚固形物精

45、制L脯氨酸成品1012.10 维生素生产工艺102一 概述 维生素是一类生物生长发育起调节作用的、化学结构不同的、小分子有机化合物,人体内不能合成,必须从食物等中摄取。人体需求量很少,但不足时,出现相应的缺乏症。已知维生素13种,根据溶解性,一般分为水溶性和脂溶性维生素两类。主要维生素的生产有三种方法。2002年我国维生素原料产量达8.2万吨,其中维生素C超过5万吨,成为世界上最大的原料药生产国和出口国。维生素制剂年产量260280亿支/片/瓶,以片剂、注射液和胶囊为主。 1032 维生素C生产工艺 目前,工业上生产维生素C采用二步发酵法,此法是在1975年由中国科学院上海生物技术研究所研究出

46、来的,属我国首创。发酵法生产维生素C可以分为发酵、提取和转化三大步骤。即先从D-山梨醇发酵,提取出维生素C前体2-酮基-L-古龙酸,再用化学法转化为维生素C。第一步发酵黑醋酸菌(Acetobacter suboxydans)经种子扩大培养,接入发酵罐,种子和发酵培养基主要包括山梨醇、玉米浆、酵母膏、碳酸钙等成份,pH 5.05.2。醇浓度控制在2427%,培养温度2930 ,发酵结束后,发酵液经低温灭菌,移入第二步发酵罐作原料。D-山梨醇转化L-山梨糖的生物转化率达98%以上。104第二步发酵氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans,小菌)和巨大芽孢杆菌(Bacillus

47、megaterium,大菌)混合培养。生产维生素C的发酵罐均在100 m3以上,瘦长型,无机械搅拌,采用气升式搅拌。种子和发酵培养基的成份类似,主要有L-山梨糖、玉米浆、尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾等,pH 值为7.0。大、小菌经二级种子扩大培养,接入含有第一步发酵液的发酵罐中,2930 下通入大量无菌空气搅拌,培养72h左右结束发酵,L-山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸的转化率可达7085%。 2-酮基-L-古龙酸的分离提纯经二步发酵法两次发酵以后,发酵液中仅含8%左右的2-酮基-L-古龙酸,且残留菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质,常采用加热沉淀法、化学凝聚法、超滤法分离提纯。传统工艺是加热沉

48、淀法,发酵液经静置沉降后通过732氢型离子交换树脂柱,调节pH至蛋白质等电点,并加热使蛋白质凝固,然后用高速离心机分离出菌丝、蛋白和微粒,清液再次通过阳离子交换柱,酸化为2-酮基-L-古龙酸的水溶液,浓缩结晶后得到2-酮基-L-古龙酸。 1052-酮基-L-古龙酸的化学转化将维生素C前体2-酮基-L-古龙酸转化为维生素C,常采用碱转化法。2-酮基-L-古龙酸在甲醇中用浓硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龙酸甲酯,加NaHCO3转化生成维生素C钠盐,经氢型离子交换树脂酸化得到维生素C。粗品经结晶精制得维生素C成品。1063 维生素B2生产工艺维生素B2(vitamin B2)又称核黄素(ribof

49、lavin),国内约有l0家核黄素生产商。目前国内外广泛采用微生物发酵法工业生产维生素B2。能够产生维生素B2 的微生物有细菌、真菌和霉菌,工业生产中主要以阿舒假囊酵母(Eremotherecium ashbyii)为生产菌种。维生素B2 的工业发酵一般为二级发酵,发酵液先沉淀再氧化进行分离提纯。 107发酵培养基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作为主要碳源,植物油中以豆油对维生素B2产量的促进效果最为显著,有机氮源以蛋白胨、骨胶、鱼粉、玉米浆为主,无机盐有NaCl、K2HPO4、MgSO4。种子扩大培养和发酵的通气量要求均比较高,通气比一般在1.0,罐压0.05 MPa左右,搅拌功率要求比较

50、高。阿舒假囊酵母的最适生长温度在2830 ,种子培养3438h后接入发酵罐,发酵培养40h后开始连续流加补糖,发酵液的pH值控制在5.46.2,发酵周期为150160h。维生素B2的产量在50 g/L左右。维生素B2的分离提取与纯化发酵液酸化后加热,然后加入黄血盐、硫酸锌沉淀蛋白,过滤后滤液调pH 1.52.0酸化,静置2040h沉淀,压滤后将沉淀物酸溶,加入硝酸铵,氧化抽提,氧化液经结晶、过滤后,湿晶在80 以下干燥20h,得到维生素B2成品。 108本章结束109第3章 基因工程制药工艺110本章内容3.1 基因工程制药微生物表达系统3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.3 基因工程菌的发

51、酵培养与控制3.4 重组人干扰素生产工艺1113.1 基因工程制药微生物表达系统112基因工程菌:微生物为操作对象,通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类:细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。113一 大肠杆菌表达系统1 大肠杆菌(Eschericlia coli)形态特征细胞:G,单细胞,杆状。鞭毛,无芽孢,一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色,光滑,直径23mm。1142 生化与遗传特性能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长,发酵糖,产气产酸。基因工程中使用菌株:K12株的衍生菌株。基因组:4.6 Mb,3000多种蛋白质

52、。染色体DNA为环状双链,核外遗传物质为质粒。1153 质粒载体复制起始点选择标记多克隆位点116质粒类型严紧型质粒:在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒,pSC101;松弛型质粒:在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒,pMB1和colE1;克隆质粒:用于克隆和扩增外源基因;测序质粒:用于基因测序;整合质粒:用于外源基因与宿主染色体整合;穿梭质粒:能在两种宿主细胞存在;表达质粒:能表达基因产物1174 产物表达形式不溶性蛋白质:细胞质内形成包涵体;可溶性蛋白质:存在于细胞质;周质表达:外源蛋白被运输分泌到周质,可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解,避免N端附加蛋氨酸;胞外分泌表达:胞内

53、可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。1185 优点和不足发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高(高达70),培养周期短,抗污染能力强。不能用于加工修饰化(糖基化、酰胺化)蛋白表达。细胞死亡后,细胞壁脂多糖游离出来,形成内毒素,具有抗原性,产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。1196 应用大量外源基因能超量的表达,18种药物上市。多肽类2种(甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽)激素:胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)细胞因子类:5种干扰素(1种PEG化)、干扰素和,2种G-CSF(1种PEG化),白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂溶

54、栓酶类:rPA白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白(疫苗)等。120二 酵母表达系统1 形态特征细胞:单细胞真核生物,球形、椭圆形、卵形。繁殖:芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落:乳白色,有光泽,边沿整齐。1212 生长与遗传特征孢子萌发产生单倍体细胞,两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞,进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速,倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序,遗传背景已相当清楚。基因组:120.68Mb,5887个ORF,编码约6000个基因。1223 优点与不足优点五种类型的载体,安全、无毒。营养缺

55、陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化,进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工,并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点酿酒酵母发酵产生乙醇,制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长,会引起副作用。1234 应用1981年Hitzman等:酵母表达人干扰素激素类:6种人胰岛素及1种突变体,尿酸水解酶和水蛭素细胞因子:GM-CSF和血小板衍生生长因子多肽类:高血糖素2种乙肝疫苗等。8种产品1243.2 基因工程大肠杆菌的构建技术125一 工程菌构建流程目标基因克隆表达载体构建遗传转化与筛选工程菌PCR、文库、化学合成酶切、连接外源基因导入与培养126二 表达载体构建表达载体设计目标

56、基因的定位克隆酶切反应连接反应转化筛选与鉴定127三 基因工程菌的建立过程适宜宿主菌的转化筛选鉴定,遗传稳定性等。目标获得质粒能稳定遗传、基因能高效和定向表达的载体,确保药物的生物活性。128表达筛选与产物鉴定不同菌种的表达筛选诱导表达时间和诱导强度的筛选产物存在形式和存在场所的鉴定表达部位胞外,周质,胞内;包涵体,可溶性蛋白表达产物结构与活性鉴定电泳,SDSPAGE,等电点电泳免疫杂交,末端测序,质谱分析分析与目标产物的同一性1293.3 基因工程菌的发酵培养与控制130一 培养基组成与控制碳源氮源无机盐选择剂诱导物1311 碳源大肠杆菌:蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源;酵母:利用葡萄糖、半

57、乳糖等单糖类物质。添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。浓度稍高后就表现出底物抑制作用。葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化。1322 氮源直接很好地吸收利用铵盐等,一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大,具有很高的选择性。大肠杆菌:利用大分子有机氮源,酵母粉等。酵母:利用氨基酸为氮源1333、无机盐磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态基因工程菌生长提供必需的矿物质。1344 选择剂selective agent维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。发酵培养过程中质粒容易丢失,使之成为宿

58、主菌。为了保证质粒的稳定性、不丢失,根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因,添加或缺陷选择剂。135选择剂种类营养缺陷互补和抗生素抗性。工程大肠杆菌:卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂;工程酵母菌:氨基酸营养缺陷型,缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。1365 诱导物诱导表达型工程菌:在细胞生长到一定阶段,必需添加诱导物,以解除目标基因的抑制状态,活化基因,进行转录和翻译,生成产物。诱导物成为产物表达必不可少的。Lac启动子表达系统:IPTG诱导。甲基营养型酵母:加入甲醇进行诱导。1376 培养基组成对质粒稳定性的影响营养较丰富的培养基,质粒稳定性高于合成培养基;限制性基

59、质对基因工程菌的比生长速率有不同影响;大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定,有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定;对于酵母,极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性;培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。138二 培养工艺与控制温度溶解氧pH1391 温度对工程菌发酵的影响生长大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10;大肠杆菌生长最适温度为37,最高温度为45;酿酒酵母生长最适温度为30,最高温度为40。生产生长与生产温度不一致;较高温度表达包涵体,较低温度下有利于表达可溶性蛋白质;对于热敏感的蛋白质,生产期可采用先高温,然后低温,变温表达,避免蛋白质降解。140温度控

60、制两段变温发酵培养:前期:较高温度发酵,获得足够高的菌体密度;后期:较低温培养发酵,对菌体合成目标产物的抑制不明显,但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成,总体提高工程菌的生产能力。温度诱导型大肠杆菌表达系统:生长期维持37,生产期提高温度42。1412 pH值对发酵的影响细菌喜欢偏碱性:大肠杆菌适宜pH为6.57.5,真菌喜欢微酸性:酵母适宜pH为5.06.0。影响产物稳定性,最适生长和最适生产pH不同。干扰素是在酸性条件下稳定,而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降,也抑制基因表达。142pH控制了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后,需要进一步

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