南开生物化学新课件02蛋白质化学

1、第 二 章蛋白质化学 Chemistry of Protein第一 节通 论一、 蛋白质的化学概念 蛋白质（protein）是由许多氨基酸（amino acids）通过肽键（peptide bond）相连形成的有特定空间结构和生物学活性的高分子含氮化合物。二、 蛋白质的生物学重要性1. 蛋白质是生物 体重要组成成分分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。2. 蛋白质具有重要的生物学功能 作为生物催化剂（酶） 代谢调节作用（胰岛素） 免疫保护作用（抗体） 物质的转运和

2、存储（血红蛋白、乳-酪蛋白） 运动与支持作用（肌动蛋白、微管蛋白接头蛋白） 参与细胞间信息传递（膜受体蛋白）3. 氧化供能* 根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质（Simple Protein）结合蛋白质（Conjugate Protein） = 蛋白质部分 + 非蛋白质部分 * 根据蛋白质形状 纤维状蛋白质（Fibrouse Protein）： 难溶于水，结构蛋白 球状蛋白质（Globular Protein）： 多溶于水，功能蛋白 三、 蛋白质的分类 * 根据蛋白质功能 /溶解度 纤维状蛋白质和球状蛋白质四、 蛋白质的元素组成 主要有C、H、O、N，还有S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜

3、、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。可通过测定含氮量来计算蛋白质：蛋白质含量 = 蛋白氮 6.251/16% 蛋白质元素组成的特点第二节 蛋白质的组成单位 氨基酸一、氨基酸一般结构特征蛋白质在酸、碱或酶的作用下，水解为氨基酸（Amino Acid）蛋白质的基本结构单位。存在自然界中的氨基酸有数百种，但组成生物体蛋白质的氨基酸（编码氨基酸）主要有20种。氨基酸结构通式（-氨基酸） 2个特殊氨基酸脯氨酸（亚氨基酸）氨基酸的构型 组成蛋白质的氨基酸除Gly（R=H）以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称

4、为D-型和L-型。D/L标记法甘油醛 D/L 分型为参考标准球棍式投影式透视式L-苏氨酸D-苏氨酸二、氨基酸的分类和结构酸碱性：中性、酸性、碱性R基结构：脂肪、芳香、杂环R基物理性质 ：疏水、亲水R基结构：依R基团结构分类非极性氨基酸（Nonpolar Amino Acids）9种极性，不带电荷氨基（Polar,Uncharged Amino Acids）6/7种 酸性氨基酸 (-)（Acidic Amino Acids）2种碱性氨基酸 (+)（Basic Amino Acids）3种含非极性R基团的氨基酸（甲硫氨酸）含极性不带电荷R基团的氨基酸含带负电荷（酸性）R基团的氨基酸含带正电荷（碱性

5、）R基团的氨基酸三、蛋白质中修饰性氨基酸 四、非蛋白质氨基酸五、氨基酸的一般性质 无色晶体或粉末状 熔点高： 200 C 紫外吸收性质：芳香、杂环氨基酸 旋光性：Gly除外 溶解性：一般溶于水、稀酸碱；不溶于 有机溶剂色氨酸 ：280 nm 酪氨酸： 278 nm 苯丙氨酸：259 nm紫外吸收大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。旋光性 组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子， 所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“”号表示。 旋光物质L-（

6、-）-苏氨酸D-（+）-苏氨酸六、氨基酸的化学性质结构 性质-氨基，-羧基 共性R基团 特性1. 两性性质和等电点氨基酸为两性离子（兼性离子、偶极离子）两性离子(dipolar ion)氨基酸在晶体或在水中主要以兼性离子形式存在氨基酸是两性电解质酸（供氢体）碱（受氢体）氨基酸的等点点（isoelectric point，pI） 在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点(isoelectric point, pI) 。 氨基酸在等电点时溶解度最小。正离子pHpI+OH-+H+OH-+H+ 实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子

7、形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。 氨基酸等电点决定于可解离基团氨基酸等点点的计算解离常数：pK值pK1 pK2 K1=A H+A+K2=A- H+A完全质子化多元酸Henderson-Hasselbalch方程：pH=pKa + lg质子受体质子供体pK值 ：指某种解离基团有一半被解离时的pH值。AA-A+甘氨酸酸碱滴定曲线pK1pK22.349.60Gly等电点的计算K1=Gly H+Gly+K2=Gly- H+GlypI时，Gly+ = Gly- 则：=Gly H+K1Gly K2H+ H+2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+p

8、K2）/2pI =（2.34+9.60）/2=5.97Gly谷氨酸酸碱滴定曲线pK2pK1pK3Glu等电点的计算pK1pK2pK32.199.674.24pI=（pK1+pK2）/2 = ( 2.19 + 4.25 ) = 3.22赖氨酸酸碱滴定曲线pK2pK1pK3Lys等电点的计算pK2pK1pK32.1810.538.95pI=（pK2+pK3）/2 = ( 8.95 + 10.53 ) = 9.742. 氨基酸的化学反应茚三酮反应亚硝酸反应甲醛的反应2.4二硝基氟苯反应（FDNB）与苯异硫氰酸（酯）的反应二甲基氨基萘磺酰氯反应（DNS - Cl）氨基酸与酰化剂（苄氧羰酰氯）的反应成盐

9、和成酯反应 茚三酮反应 氨基酸与茚三酮水合物弱酸条件下共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。Pro黄色（440nm）氨、胺不放CO2亚硝酸反应氨基酸羟酸用途：氨基酸定量；蛋白质水解程度测定甲醛滴定甲醛反应 一羟甲基衍生物二羟甲基衍生物pH=pK + logH2NCH2COO-H3+NCH2COO-+OH-弱酸2.4-二硝基氟苯（FDNB/DNFB）反应（Sanger） 室 温 pH 8-9FDNBDNP-氨基酸（黄色）苯异硫氰酸（PITC，Edman反应）PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸PTC：苯氨基硫

10、甲酰； PTH：苯乙内酰硫脲5-二甲氨基萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反应用途：N端氨基酸标记；微量氨基酸定量荧光酰基化反应苄氧羰酰氯苄氧羰酰-氨基酸用途：蛋白质人工合成中氨基保护剂成盐和成酯反应七、氨基酸的分离和分析鉴定蛋白质的水解氨基酸混合物 酸水解：6 mol/L HCl, 110 120 C , 24 h 碱水解：5 mol/L NaOH 110 C , 24 h 酶水解：（部分水解）氨基酸的分离鉴定 纸层析 薄层层析 离子交换柱层析 纸层析(paper chromatography) 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流

11、动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：（物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响Rf值）Rf 原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离原点前沿双向纸层析薄层层析（thin-layer chromatography ） 以硅胶、氧化铝、纤维素粉等为支持剂 支持剂涂布于玻璃板上均匀薄层 样品滴加在薄层一端离子交换柱层析（ion-exchange column chromatography） 以离子交换树脂作为支持物，离子交换树脂上的活性基团可与溶液中的离子（氨基酸）进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与

12、树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。离子交换树脂： 人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物阳离子交换树脂阴离子交换树脂AA2.975.689.74第三节 蛋白质的结构自然界存在的蛋白质1010-1012组成蛋白质的氨基酸20种20世纪50年代初，Linder stron-Long：蛋白质具有不同结构层次 一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure)高级结构蛋白质的分子结构包

13、括:一、 蛋白质的一级结构(primary structure)定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序和连接方式。主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。(Peptide bond, Disulfide bond) 1. 肽键和肽链肽键(peptide bond): 一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的共价键，又称酰胺键 。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽键的形成+胱氨酸二硫键-HH 二硫键的形成半胱氨酸肽和多肽链* 肽：氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨 基酸缩合则形成三肽* 由少于10个氨基酸相连而成的肽称为寡 肽 (olig

14、opeptide)，由更多的氨基酸相连形 成的肽称多肽(polypeptide)。* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸 之间以肽键连接而成的一种结构。 多肽链的特点* 氨基酸残基(residue)：肽链中的氨基酸分子 因为脱水缩合而基团不全。* 多肽链有两端:(Amino ,Carboxyl terminal) N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端* 结构骨干(Backbone) 由-N-C-C-重复排列 N：酰胺氮 ， C：手性碳原子，C：羰基碳 一级结构的含义、特点和意义 含义：氨基酸种类：20氨基酸数目：总数，每种氨基酸数目氨基

15、酸连接次序特点：方向性 多样性意义：生物学功能的基础 空间结构的基础 2. 几种生物活性肽 谷胱甘肽(glutathione, GSH)多肽类激素及神经肽体内许多激素属寡肽或多肽多肽抗菌素 革兰氏阳性菌 神经肽(neuropeptide) 脑啡肽（高等动物脑组织）：内源性吗啡样活性物质，镇痛蛋氨酸脑啡肽：HTyr-Gly-Gly-Phe-MetOH亮氨酸脑啡肽：HTyr-Gly-Gly-Phe-LeuOH含脑啡肽的神经元与疼痛 SP： P物质-神经末梢释放兴奋递质E:脑啡肽-与阿片受体结合，减少感觉神经末梢释放P物质3. 肽链的表示方式N 端C 端胰岛素（Insulin）4. 一级结构的测定意

16、义：阐明蛋白质活性中心 了解结构与功能的关系 说明分子进化、遗传与变异等现象 了解分子病发病机制人工合成蛋白质测定步骤 纯化蛋白质样品 测定蛋白质的分子量和氨基酸组成 氨基酸末端分析（N-端、C-端 ） 肽链的拆分 肽链的部分水解分离纯化各肽段并采用Edman(PITC)降解法测序用重叠法推断肽链全部氨基酸序列二硫键的定位氨基酸末端分析N端分析方法 24-二硝基氟苯法（FDNB ） 苯异硫氰酸法（PITC） 二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）C端分析方法 肼解法 羧肽酶法24-二硝基氟苯法（FDNB ）Sanger pH 8-96mol/L HClDNP肽乙酸乙酯抽提后只有DNP-氨基酸留在有

17、机相DNP-氨基酸（黄色）苯异硫氰酸法（PITC）/ Edman降解法 加热二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）肼解法羧肽酶法 羧肽酶（carboxypeptidase ）：作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸。 羧肽酶 A: 除 Lys , Arg , Pro， Pro ( -2 ) 羧肽酶B： 水解 Arg , Lys , 非( Pro -2 ) 肽链的拆分 非共价键：变性剂 共价键：二硫键 过甲酸氧化法 还原法肽链的部分水解 化学法：溴化氰（CNBr）法 酶法：胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 溴化氰（CNBr）裂解法肽酰高丝酸内酯专一水解甲硫氨酸羧基形成的肽键胰蛋白酶Trypsin Lys-ProArg-Pro 胰凝乳蛋白酶/糜蛋白酶（chymotrypsin）：芳香族氨基酸的羧基端 ( Phe，Tyr， Trp ，不于Pro相连) 胃蛋白酶（pepsin）：断裂键的两端均为疏水氨基酸( Leu-Val)胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶/糜蛋白酶嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶内肽酶片段重叠法 N -A-B-C-D-E-F-G-H-M-N- C 酶1 A-B-C-D E-F-G H-M-N酶2 A-B-C D-E-F G-H-M-N二硫键的定位 对角线电泳 过甲酸练习 12肽胰蛋白酶水解： Phe-Ala-Lys，Ser-Glu-Asn， Ala-Ile-Tyr-Met-Gly-Ar