生物：11.2《基因工程的基本操作程序》(新人教版选修3)000000000课件

1、 1.2 基因工程的基本操作程序 原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子不编码蛋白质。：编码蛋白质 ,连续不间断编码区非编码区原核细胞的 基因结构调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子启动子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间

2、隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因主要是指_编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成(1)从基因文库中获取目的基因什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因

3、,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.某生物体内全部DNA 许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接 导入基因组文库直接分离基因基因组文库与部分基因文库的关系思考：基因文库如何构建？ 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的cDNA文库。这种方法称反转录法cDNA文库的构建mRNA 反转录cDNA(互补DNA） DNA聚合酶双链DNA反转录法：基因重组反转录酶mRNAcDNA（3）如何从基因文库中得

4、到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC（2）利用PCR技术扩增目的基因PCR聚合酶链式反应

5、 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。PCR技术原理：前提：原料方式PCR扩增仪DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列：以_方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子 过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、 _、_ 、 _.

6、原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）聚合酶链式反应体外特定DNA片段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物DNA聚合酶指数2n DNA复制PCR技术与体内DNA复制的区别：1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。 利用PCR技术扩增目的基因3、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基

7、因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。 编码蛋白质核苷酸染色体转录表达体外核苷酸引物人工合成二、基因表达载体的构建核心（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基

8、因DNA连接酶表达载体同种1.过程:2、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平

9、，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_

10、和_的过程受体细胞稳定表达1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌（2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。基因枪法（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌

11、发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物 用口径为1m的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。什么叫显微注射技术？3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大

12、肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA细菌0二价阳离子Ca2+、Mg2+42用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定检测鉴定检测基因表达载体是否进入了受体细胞检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检查是否成功检测目的基因是否转录出了mRNA检测转基因生物染色体的DNA 上是否插 入了目的基因检测转基因生物染色体的DNA上是否插入 了目的基因过程:A. 首先取出转基因生物的基因组DNAB. 对含目的基因的DNA片段作放射性同位素 标记，以此做探针C. 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示

13、出杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中方法:DNA分子杂交DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:分 子 杂 交方法:抗原-抗体杂交过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA.鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死

14、亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？ 针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入_中，原因_（3）通常采用_技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_细胞中特异表达。显

15、微注射 受精卵 受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应的组织细胞中表达。DNA分子杂交膀胱上皮 （或早期胚胎）思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增

16、加一些其他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：(四)目的基因的检测与鉴定检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞方

17、法DNA分子杂交表达检测转录检测分子杂交翻译检测抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定知识延伸DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。返 回思考与探究：2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等

18、，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆