基因工程课件

1、 基因工程原理 与应用主要内容：植物基因工程动物基因工程微生物基因工程3概述124一、概述 一百四十年前，在捷克一个修道院里沉醉于豌豆杂交实验的Mendel也许根本就没有想到，他提出的遗传因子在半个世纪后被Morgen定义为基因；而且1944年Avery证明了基因的物质基础是DNA；五十年代初Watson和Crick又揭示了DNA的分子结构；七十年代初DNA已可在体外被随意拼接并转回到细菌体内遗传和表达。生命科学的飞速发展孕育了现代分子生物学技术基因工程的诞生。Sub title 从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，

2、使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因。 基因工程的定义：基因工程的定义： 广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即狭义的基因工程）；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。 基因工程（上游技术）的步骤： （1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开（简称切）；

3、 （2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子（简称接）； （3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中（简称转）； （4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中（简称增）； （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）。 由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为：切、接、转、增、检。 基因工程过程示意图从细胞中分离出DNA限制酶截取DNA片断分离大肠杆菌中的质粒 DNA重组用重组质粒转化大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因限制性内切酶的定义 限制性内切核酸酶的定义：限制性内切核酸酶是

4、一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。DNA连接酶 DNA连接酶的定义:一种能封闭DNA链上缺口的酶,借助ATP或NAD水解提供的能量,催化DNA链的 5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键.载体要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是载体。 作用：将外源基因送入受体细胞。 条件： 能在宿主细胞内复制并稳定地保存。 具有多个限制酶切点。 具有某些标记基因 种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。提取目的基因将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。取 出DNA用限

5、制酶切断DNA 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。提取目的基因的方法（一） 直接分离基因鸟枪法 将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。用限制酶切成许多片断提取目的基因的方法（二） 人工基因合成法逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。直接合成法：根据蛋白质的

6、氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。DNA合成仪PCR扩增仪 目的基因与载体结合 用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。提取质粒并用限制酶切割用连接酶将目的基因和质粒连接将目的基因导入受体细胞并扩增 基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。 导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。 目的基因可以随着受

7、体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增二、高等植物基因工程 广泛应用于微生物系统的重组DNA技术在高等植物尤其是农作物的品种改良方面也日益显示出其重大的经济意义。将相关的单一基因或小型基因蔟导入植物体内，可培育出具有抗病虫害、抗除草剂和抗环境压力等多种优良遗传品质的农作物。目前大量的农作物转基因品种已经问世，其中包括水稻、玉米、马铃薯、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、亚麻、甜菜、甘草、番茄、生菜、胡萝卜、卷心菜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果和葡萄等。不久的将来，人们在超市的货架上还可看到自然界不存在的全新

8、转基因蔬菜和水果。 转基因技术在植物品种改良中的应用 控制果实成熟1抗虫害2抗病毒33抗除草剂44改变花型花色35 1、控制果实成熟 蔬菜和水果成熟后，其组织呼吸速度和乙烯合成速度普遍加快，并迅速导致果实皱缩和腐烂。控制蔬菜水果细胞中乙烯合成的速度，能有效延长果实的成熟状态及存放期，为其长途运输提供了有利条件，具有重要的经济价值。 植物细胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。九十年代初，科学家们采用反义RNA技术封闭蕃茄细胞中上述两个酶的编码基因的表达，由此构建出的重组蕃茄的乙烯合成量分别仅为野生植物的3%和0.5%，明显增长了蕃茄的保存期。目

9、前，类似的研究以扩展到了草莓、苹果、香蕉、芒果、甜瓜、桃子以及梨等多种水果。 2、抗虫害 昆虫对农作物的危害极大，目前对付昆虫的主要武器仍是化学杀虫剂，它不但严重污染环境，而且还诱使害虫产生相应的抗性。苏云金芽孢杆菌作为天然的微生物杀虫剂在美国已使用了三十年，该细菌能合成一种分子量为125KD的晶体蛋白，对许多昆虫包括棉蚜虫的幼虫具有剧毒作用，但对成虫和脊椎动物无害。实际上苏云金芽孢杆菌产生的只是由1,187个氨基酸残基组成的无活性毒素原蛋白，幼虫接触到毒素原蛋白后，其消化道中的蛋白酶将之水解成68KD的毒性片段，后者与幼虫中肠细胞表面的受体结合，从而干扰细胞的生理过程。然而通过发酵苏云金芽孢

10、杆菌生产这种生物杀虫剂，成本颇高，且晶体蛋白原在环境中并不稳定，因此保护期很短。 将苏云金芽孢杆菌晶体蛋白编码基因移植到农作物体内的研究持续了许多年，但这个全长基因在植物细胞中的表达率甚低，其主要原因是细菌基因的密码子选用规律与植物相佐，而且毒素蛋白原的分子也太大。为此，改进表达效率的方法是只克隆晶体蛋白与毒性有关的N端1615位氨基酸残基片段，其中1453编码区采用人工合成片段以纠正密码子的偏爱性，同时将该重组基因置于双CaMV启动子串联结构的控制之下（图7-9），这使得毒性蛋白在棉花细胞中的表达水平提高了100倍。 此外，有种蛋白型丝蛋白酶抑制剂可有效干扰昆虫的消化功能并置于死地，它在蕃茄

11、和马铃薯等植物细胞中只有痕量存在。转基因烟草的实验结果表明，这种抑制剂的高效表达可赋予植物广谱的抗虫害能力，若将细菌毒素蛋白和丝蛋白酶抑制剂编码基因双双整合到植物染色体上，则转基因植物的抗虫害能力比只含毒素蛋白基因的植物提高20倍。 3、抗病毒 农作物病毒感染是一个严重的问题，它可导致农作物生长缓慢、产量降低和质量减退。构建抗病毒的转基因植物有两种战略：即转病毒包衣蛋白基因和转病毒复制酶亚基的反义基因。 在经典植物遗传学中，通常利用交叉保护原理筛选抗病毒的优良品种，即将一种较为温和的病毒感染植物，培育出来的子代植物一般能抵御更为严重的同类病毒的侵袭。这种类似于动物疫苗接种的现象表明，病毒的包装

12、蛋白对免疫保护作用十分重要。因此在植物细胞中克隆表达病毒包衣蛋白基因，有可能构建出抗病毒的优良品种。 第一个实验是在烟草中进行的。烟草花叶病毒（TMV）是一种双链RNA病毒，其基因组全长6.5 kb，共编码四种多肽：两个复制酶亚基、一个包衣蛋白（CP）以及一个宿主结合蛋白。高效表达CP基因的转烟草植物在TMV存在时，能维持抗病毒状态30天左右，而正常植物三至四天后便出现感染症状。这种CP转基因技术在马铃薯、蕃茄和苜蓿等植物中也已获得成功。 此外，将TMV 5端含复制酶亚基编码序列的片段作为目的基因，成功地构建了反义基因的转烟草植株。实验结果表明，病毒RNA基因组的复制被抑制了2550倍，植物的

13、病毒感染症状消失或大为减少。 黄瓜花叶病毒（CuMV）的基因组由三个分离的单链RNA分子构成，它们分别编码三种特异性的病毒蛋白。在感染周期中，RNA3被编辑去除一段序列，形成编码病毒包衣蛋白的RNA4链。为了构建抗CuMV的黄瓜转基因新品种，可将RNA4的cDNA反向克隆在农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒的T-DNA区内，其上下游分别加装来自花椰菜花斑病毒的35S启动子（p35S）以及植物核糖二磷酸羧化酶小亚基基因的终止子序列（tRBC）。重组分子经农杆根瘤菌整合在植物的染色体上，由此培育出的黄瓜新品种明显表现出对CuMV病毒的抗性。 4、抗除草剂 在大田里，尽管每年花费了上百亿美元使用一百多种化

14、学除草剂，但杂草的生长仍使农作物减产10%。目前使用的除草剂特异性不强，或多或少会影响农作物的生长，从而限制了除草剂的大量使用。利用转基因技术构建抗除草剂的重组植物可望解决这一问题，其战略包括：抑制农作物对除草剂的吸收；高效表达农作物体内对除草剂敏感的靶蛋白，使其不因除草剂的存在而丧失功能；降低敏感性靶蛋白对除草剂分子的亲和性；向农作物体内导入除草剂的代谢灭活能力等。 除草剂中使用最广泛的是Glyphosate，因为它以很小剂量即可杀灭各种杂草，进入土壤后能被微生物迅速降解，基本上不污染环境。其除草机理是强烈抑制植物叶绿体芳香族必需氨基酸生物合成途径中的5-烯醇式丙酸基莽草酸-3-磷酸盐合成酶

15、（EPSPS）活性。将来自矮牵牛花的EPSPS cDNA导入植物中，转基因植物细胞内的EPSPS活性提高了20倍，对除草剂的耐受性也相应增加，但转基因植物生长缓慢。另外，从一种抗Glyphosate的大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因，将其置于植物启动子、终止子和多聚腺苷酸化位点的控制之下，并转入植物细胞内表达，由此构建的转基因烟草、藩茄、马铃薯、棉花以及矮牵牛花能合成足够量的EPSPS变体蛋白，以取代被Glyphosate抑制了的植物酶系，从而表现出较高水平的除草剂抗性。 溴氰衍生物（3,5-二溴-4-羟-苯甲氰）是一类抑制植物光合反应的除草剂。臭鼻克雷伯氏菌能产生一种水解酶，将上述溴氰衍

16、生物特异性降解为3,5-二溴-4-羟-苯甲酸。目前编码该酶的基因已被克隆，并在植物核糖二磷酸羧化酶小亚基基因所属的光控启动子的调节下成功地在烟草中获得表达。5、改变花型花色 全世界每年花卉产业的产值高达上百亿美元，通过插花工艺装饰花束和花篮需要培育各种花卉植物。目前构建具有不同花型和花色特征的转基因植物已成为可能，有关研究工作主要集中在世界最大的花卉出口国荷兰。 花卉的颜色是由花冠中的色素组成成份决定的。大多数花卉的色素为黄酮类物质，由苯丙氨酸通过一系列的酶促反应合成，而颜色主要取决于色素分子侧链取代基团的性质和结构，如花青素衍生物呈红色，翠雀素衍生物呈蓝色等。在黄酮类色素的生物合成途径中，苯

17、基苯乙烯酮合成酶（CHS）是一个关键酶。利用反义RNA技术可有效抑制矮牵牛花属植物细胞内的CHS基因表达，使转基因植物花冠的颜色由野生型的紫红色变成了白色，并且对CHS基因表达抑制程度的差异还可产生一系列中间类型的花色。相同的实验程序也可使野生型烟草花冠的桃红色转变为白色。天然的玫瑰没有蓝色的花冠，因为蔷薇科植物缺少合成蓝色色素的酶系，将矮牵牛花的蓝色色素合成基因引入蔷薇科植物体内，可望培育出蓝色的重组玫瑰花。 三、高等动物基因工程 动物转基因技术的不断发展大加快了培育动物优良种系的进程，同时也为战胜严重威胁人类健康的各种分子疾病提供了崭新的治疗模型。含有人促生长激素基因的转基因鱼可提高其生长

18、速度近5倍，澳大利亚培育出的转基因山羊能使羊毛增产5%以上，越来越多的转基因动物正从实验室走向牧场。 转基因技术在动物遗传性状改良中的应用转基因鼠1转基因兔、猪和羊2转基因牛33转基因鸡44转基因鱼35 1、转基因鼠 构建转基因鼠的主要目的是建立人类分子病的研究模型，它能在较短的时间内模拟人类疾病的发生和发展过程，同时又为药物疗法和基因疗法提供体内试验系统。尽管从转基因鼠身上获得的有关病理学知识并不都是人体的真实写照，但在相当多的情况下这个模型的确能帮助人们了解一些严重疾病复杂的发病机理，如老年痴呆症、肌肉营养不良症、变性神经症、风湿性关节炎、恶性肿瘤、内分泌功能紊乱、高血压以及冠心病等。 例

19、如：在老年痴呆症发病频率较高的家族成员中均存在APP基因的突变，由此怀疑这是该病的病因，但在人体中几乎无法研究疾病的发生与发展过程。人们发现小鼠的某些种系能形成老化斑，而另一些种系则天生不会产生。以后一种系的小鼠为受体，将人APP基因转入其体内，构建相应的转基因鼠模型，以此研究老年痴呆症的分子机制。人缺陷基因在转基因鼠的脑神经元中获得表达，并产生相应的症侯群，该病的发病机理遂得以确立。上述转基因结构包括一个来自脑特异性病毒的启动子以及编码b-淀粉前体蛋白C末端100个氨基酸残基的人APP基因部分序列。 含有人生长激素基因的转基因猪生长期显著缩短，且饲料利用率及瘦肉比重大幅度提高，具有可观的经济

20、意义。然而这种转基因猪体质相当虚弱，可能是由于生长激素在其生长发育中全程表达的缘故，因为在正常生理条件下内源性生长激素的存在周期通常只有两个月左右。此外，生长激素基因在猪体内呈基底表达特征，在饲料中添加锌仅使生长激素表达量提高两倍，因此选择其它性能优异的可控性启动子有望改善转基因猪的体质。 2、转基因猪 3、转基因牛 目前转基因牛主要限于转基因奶牛，其目的之一是改变牛奶的成份。从牛奶生产奶酪的产率正比于牛奶中k-酪蛋白的含量，k-酪蛋白转基因的高效表达可显著提高牛奶中k-酪蛋白组份的比率。乳糖酶转基因在牛乳腺细胞中的表达能导致产生无乳糖牛奶，这种牛奶深受那些对乳糖过敏或消化不良的人群的欢迎。上

21、述两种转基因奶牛均已问世。转基因牛的另一目的是借助于转抗体基因和转病毒细菌蛋白基因培育抗菌、抗病毒和抗寄生虫的新品系。现在的大型养牛场仍采用疫苗免疫、物理隔离和药物治疗的传统方法控制大面积的感染，其花费高达饲养总成本的20%，由此可见这种转基因牛构建具有重要的经济价值。4、转基因鸡 提高肉鸡和蛋鸡的抗感染能力是转基因鸡研究的主要目标，其战略为病毒包衣蛋白转基因的表达，目前能稳定产生家禽白血病毒（ALV）包衣糖蛋白（由env基因编码）的转基因鸡已经问世。5、转基因鱼 随着天然鱼种的大批灭种，利用转基因技术改良食用鱼品质的研究日益显示其重要性。目前采用受精卵的DNA显微注射技术转基因已在鲤鱼、鲶鱼

22、、鲑鱼和罗非鱼等种属中获得成功。鱼的卵细胞原核在受精之后不易观察，所以通常将转基因DNA注射到受精卵的胞质或处于四细胞发育阶段的胚胎中。与高等哺乳动物的胚胎发生过程不同，鱼卵的发育是外生型的，因此转基因胚胎无需移植操作，仅在温度控制的水池中便可进行。鱼胚胎经DNA显微注射后的存活率也相当高，一般可达35-80%，而转基因的总有效率也有10-70%，转基因鱼种在多轮交配后，仍能保持稳定的遗传性状。四、微生物基因工程 人类药物的生产1疫苗生产2食品和饲料生产33环境保护44农业生产351、人类药物生产 基因工程产品约有2/3用于人类疾病治疗和预防性用药，它给制药工业带来了革命性的变化。据估计，人用

23、蛋白药物的全球市场，每年可达200亿美元，而且还在持续增长。在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。 例1：胰岛素是由人和动物的胰脏-胰岛细胞合成的蛋白质，是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药物。 1982年，美国Ely Lili公司使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，这是第一个上市的基因工程药物。 例2：人生长激素（hGH），又叫做促生长素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病诸如垂体性侏儒症、特纳氏综合症、组织坏死等，都具有良好的治疗效果。 hGH的来源是从死人的脑垂体中提取，这种制备方法不仅材料来源困难，无法大量生产，而且存在安全性问题。 1985年，

24、这种由 E.coli 生产的rhGH已成为得到美国政府许可生产和使用的第二种基因工程药物。 基因工程疫苗是指用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的产物或重组体本身制成疫苗。用基因工程方法对细菌和病毒进行改造，以去除与毒力有关基因获得的缺失突变株制成疫苗，这种疫苗称为基因缺失活疫苗。对于致病性病毒而言，单纯的外壳结合蛋白即可在受体体内激发生成足够多的抗体。通过重组DNA技术构建的只含有一种或几种抗原，而不含有病原体的其他遗传信息的工程菌生产的疫苗，称为基因工程亚单位疫苗。 2、疫苗生产基因疫苗，是指使用能够表达抗原的基因本身（即核酸）制成的疫苗。其显著特点是疫苗制剂的主要成分不是基

25、因表达产物或重组微生物，而是基因本身（即核酸）。蛋白工程疫苗是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以期达到增强其产物免疫性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。3、食品和饲料生产（一）重组工程菌与干酪生产干酪生产过程中存在问题：在发酵中，使用的原本具有良好性能的引子培养物，会突然变质生产出不合格的劣质产品。引子培养物易遭受噬菌体感染，给干酪生产造成严重的经济损失。干酪工业生产中排放的废物对环境的污染问题。可应用重组DNA技术，把参与乳制品发酵作用的质粒基因整合到乳酸链球菌的染色体基因组上，便能够培育出高稳定性的供作引子培养物的工程菌株。 （二）重组工程菌与单细胞蛋白质生产（三）重组工程菌与酿酒工业微生物蛋白产品又称为单细胞蛋白，是