ZX-基因工程的酶学基础课件

1、第二章 基因工程的酶学基础Enzymes1本章节内容第一节 限制性内切核酸酶第二节 DNA连接酶第三节 DNA聚合酶和反转录酶第四节 DNA修饰酶第五节 外切核酸酶第六节 单链核酸内切酶2本章学习内容 重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。 3DNA 重组技术的基本工具DNA重组技术的基本工具“分子手术刀” 限制酶 “分子缝合针” DNA连接酶 “分子运输车” 基因进入受体细胞的载体 4细菌供体细胞取出质粒取出DNA用限制酶切断DNA用连接酶连接目的基因将重组DNA导入受体细胞扩增基因工程图解512345脱氧核苷酸的结构

2、7 G1234512345 A3,5-磷酸二酯键3端5端3端5端磷酸二酯键8你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使

3、限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 101112限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。（1）限制（Restriction）14细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification） Dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基15（3）限制与修饰系统相关的三个基因 hs

4、d R: 编码限制性内切酶 hsd M: 编码限制性甲基化酶 hsd S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNA的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。171973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：二、限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示1

5、82. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如 Hind ：d菌株 EcoR I ：抗药性R质粒 193. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如Hind ：d菌株中发现的第二个酶4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如 R.Hind 表示限制性内切酶 M.Hind 表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。20 型限制性内切酶 目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主

6、要的三种：三、限制性内切酶的类型 型限制性内切酶 型限制性内切酶 21首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。（1）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1. 型限制性内切酶的基本特性 如 EcoB和 EcoK。未甲基化修饰的特异序列。22首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。与DNA的来源无关，即没有种的特异性。2. 类限制性内切酶的基本特性 分离的第一个酶是Hin

7、d 基因工程用途最大24稀有切割限制酶（rare cutter）可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。如Not I （GCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。如Hind 可识别4种核苷酸序列： Y: C或T R: A 或GGTYRAC -35-2527仔细观察各限制酶 识别的特定序列有何 特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列27黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割 被限制酶切开的DNA两条单链的切

8、口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。28SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaI限制酶的作用在G与C之间切割29平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。30基因的针线：DNA连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割31含有几个核苷酸单链的末端

9、。分两种类型：GAATTC CTTAA GG AATTCCTTAAG5-33-55-33-51 粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 5端凸出（如EcoR I切点）32CTGCAG GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC） 3端凸出（如Pst I切点）33i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易得多。2 粘性末端的意义 连接便利3435B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端

10、。A 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 末端标记 补平成平齐末端363 平齐末端（blunt end）在识别序列的对称轴上同时切割5-GATATC -33-5CTATAG 如EcoR V374 平齐末端的特点连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法）添补法： 利用DNA聚合酶 (klenow fragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。38）削除(平)法 利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端39不同来源的酶，识别相同的序列

11、，切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如Hind 和Hsu IHind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-55 同裂酶（Isoschizomer) 完全同裂酶：40Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。 不完全同裂酶：41识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5BamH IBcl I5-TGATCA-3 3-ACT

12、AGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；Y代表嘧啶。6 同尾酶(Isocaudamers）425-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5-G3-CCTAGGATCT-3 A-5BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5BamH IBgl Sau 3A43限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。

13、所以一般使用专一的反应缓冲液。 7 限制酶的酶活性 星号（*）活性44EcoR I和BamH I等都有*活性。在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！745 诱发星号（*）活性的原因）高甘油含量）内切酶用量过大）低离子强度）高pH）含有机溶剂，如乙醇）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件46在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。移动切割（shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNNNN

14、538s型限制性内切酶47（3）型限制性内切酶不具有甲基化功能型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。如 EcoR I限制性内切酶和EcoR I甲基化酶前者：5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5后者：5-GAA*TTC-3 3-CTT*AAG-5作用的位点也不相同48（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低如：Hha切割单链DNA比切割双链DNA效率低50493. 类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋

15、氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG50核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性 类内切酶类内切酶类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、 Mg2+和SAMMg2+ATP、 Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC 回文序列（ s型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG51切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链位于寄主特异性位点或其附近

16、距寄主特异性位点3端2426bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用处不大52四、限制性内切酶酶解反应条件1. 标准酶解体系的建立 一个单位（U）的限制性内切酶定义： 在合适的温度和缓冲液中，在20l的反应体系中，1h完全酶解1gDNA所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间532. 酶解过程 配酶解体系 混匀 反应终止 酶解结果鉴定54 酶解体系一般20l，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序

17、一般是：ddH2O buffer DNA 酶 55大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低盐酶100 mM 中盐酶150 mM 高盐酶Volume20 - 100 mlT T37 1 - 1.5 hr56 混匀移液枪吹打或手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。57反应终止三种方法：）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度 10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（SDS） 至终浓度0.1%(W/V)

18、）65加热20min或者70加热10min）酚/氯仿抽提58 酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察然后决定是否终止反应59酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带酶存在“星号”活性，造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物DNA中可能存在其它DNA污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常 底物DNA不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常603. 限制性内切酶对DNA分子的消化 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现型限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。CTTAAGGAATTC（1）内切酶与识别序

19、列的结合模式 61内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开12341234（2） 完全消化62只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。123414（3） 局部消化63（4） 几种常用限制酶识别位点6465AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG * *MaeII HpacMspIc * Alu I *A*T Nla A*T ApoI Hind Afl III AgeIBsrFI A*T A*T SspI A*T （5）限制性内切酶识别序列的交叉列表 66AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG A

20、*T Nsp7524 C*G NcoIStyIDsa I XmaIAvaI C*G NdeI C*G Pml IBsaAI PvuIINspBII SmaI C*G C*G G*C EcoRIApoI NgoMIBsrFI 67AATT ACGT AGCT ATAT CATG CCGG G*CBseHI G*CEcl136II EcoRV NaeI G*CG*C AatII SacIBanIIHgiAIBsp1286 SphINsp7524 T*A BspHI BspMII T*A T*A SnaBIBsaAI T*A T*A 68CGCG CTAG GATC GCGC GGCC * MboI

21、cSau3AIc *BfaI HinpI * BstUI DpnI HaeIII *HhaIA*T A*T MluIAfl III SpeI Bgl IIBstYI A*T A*T Eco47III StuI A*T 69CGCG CTAG GATC GCGC GGCC A*T HaeIIC*G DsaI AvrIIStyI EagIEaeIGdiII C*G C*G NspBII C*G SacII PvuI C*G BsiEI BsiEI G*C BssHII NheI BamHIBstYI KasIBanI Bsp120I 70CGCG CTAG GATC GCGC GGCC G*CNa

22、rIBsaHI G*CG*CG*C T*A BbeIHaeII ApaIBanIIBsp1286 T*A XbaI Bcl I EaeI T*A NruI FspI MscI T*A T*A 71GTAC TATA TCGA TGCA TTAA * *Csp61 TaqI MseI * RsaI *A*T A*T A*T ClaI AseI A*T ScaI A*T 72GTAC TATA TCGA TGCA TTAA A*T Nsi I C*G Bsi WI SfcI XhoI AvaI AvaI SfcI C*G C*G C*G C*G PstI G*C Asp718BanI Sal I

23、ApaLI 73GTAC TATA TCGA TGCA TTAA G*CAccI AccI G*CBsrl107I HincII HpaIHincII G*C G*C KpnI Bsp1286HgiAI T*A T*A BstBIT*A DraI T*A T*A 744. 限制性内切酶酶解反应中的注意事项 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液1U的酶液足以在1h内消化10g DNA，酶和底物比例2-10U/ug DNA,避免使用过高的酶浓度 浓缩液使用前可用1限制酶缓冲液稀释 限制性内切酶在含50%的甘油的缓冲液 中，于-20稳定保存75 酶分装成小份，避免反复冻融 反应中尽可能少加水，使反应体

24、积减到最低 通常增加反应时间，可降低酶量76DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1. DNA的纯度 五、影响限制性内切酶活性的因素纯化DNA加大酶的用量，1ugDNA用10U酶延长保温时间扩大反应体积（ 20l）一般采取77需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA。78大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2. DNA的甲基化程度 DNA

25、腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas ,dam) （修饰GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas ,dcm)（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。79不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。每微克DNA用15单位的酶，保温12小时。 酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApa IBcl IMae IITaq I30505065Apy IBstE IIMae III306055Ban IMae ISma I5045253. 温度 80是影响限制酶活性的重要

26、因素4. 缓冲液(Buffer) （1）缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度Tris-HCl： 维持pH,大多数为7-7.6二硫苏糖醇（DTT）： 防止酶氧化,保持酶稳定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白质,防止酶在低 浓度的蛋白质溶液中变性商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液81（2）两种或两种以上的酶切割DNA样品 在相同的缓冲液中反应同时进行 若需要不同的缓冲液,采用3种方法)先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶）,再加NaCl调节 离子强度,并用第二种酶切割（高盐酶）；)先用一种酶切割,然后用2.5倍体积的乙醇沉淀酶解产物, 再重悬于另一种缓冲液中进行第

27、二种酶切割；)使用所有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸钾 buffer),经适当稀释可达到各种限制性酶要求的buffer条件。82练习题何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是 【 】 修复自身的遗传缺陷 促进自身的基因重组 强化自身的核酸代谢 提高自身的防御能力 补充自身的核苷酸消耗 83从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。第二节 DNA 连接酶一、DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制一定有断口84DNA连接酶:一种能够催化在两条DNA链之

28、间形成磷酸二酯键的酶1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。 85（1）大肠杆菌连接酶1. 两种共价连接DNA限制片段的DNA连接酶只能连接粘性末端，背景低，准确性高二、DNA ligase的特点（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端86（1）必须是两条双链DNA（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中： NAD+2. 连接条件87（4）DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50 - 100 mM，pH 7.5MgCl210 mMATP0.5

29、 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 mlT T 4 - 15 ， 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind 片段）所需的酶量。881. ATP（NAD+)提供激活的AMP。三、连接反应的机理2. AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi （NMN） 。3. AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi894. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一 条链的5端 P 上，形成“DNA-腺苷酸

30、”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP905. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出AMP。91如何连接由限制性内切酶切割形成片断的末端 ？92两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！93DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用94连接酶反应的最佳温度是37C。四、连接反应的温度1. 最佳温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。2. 实用温度所以一般采

31、用 416C95增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。1. DNA末端的浓度五、影响连接反应的因素1020倍2. 插入片段与载体的浓度比例 两种构型：线状分子和环状分子与DNA浓度及DNA分子长度相关963. 反应温度黏性末端：1216平头末端：10204. ATP浓度一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L.ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。97六、DNA连接的反应体系酶切纯化后的DNA片断连接缓冲液DNA连接酶98从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内

32、部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。七、平头双链DNA片段的连接操作99加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM提高平头末端连接效率的方法包括：100DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象 作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形

33、成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键101核苷酸分子的连接：ATGCATGCDNA聚合酶连接单链DNA把单个脱氧核苷酸连接到DNA片段上102第三节 DNA聚合酶DNA聚合酶（DNA polymerase)能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3OH末端，催化核苷酸的聚合作用.103一、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶2. Klenow fragment3. T7 DNA聚合酶4. T4 DNA聚合酶5. 修饰过的T7 DNA聚合酶6. 逆转录酶7.Taq DNA聚合酶104A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合

34、酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用返回1051. 共同特点把dNTPs连续地加到引物的3OH端2. 主要区别T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。二、常用的DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。106DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低无中低T4 DNA聚合酶高无中低T7 DNA聚合酶高无快高化学修饰T7 DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中Taq DN

35、A聚合酶无有快高3. 常用DNA聚合酶的特性比较107三、DNA聚合酶在基因工程中的用途1. 大肠杆菌DNA聚合酶 主要用来制备带放射性标记的DNA探针（32P标记）。（1）大肠杆菌DNA聚合酶的性质一条单链多肽53外切酶活性位于N端用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分,就成为Klenow fragment。108 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 带有3-OH游离端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件-OH53dNTPs109标记 核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子

36、。（3）用DNA聚合酶制备探针已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交110标记已知序列的核酸片断 探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断53111 DNA聚合酶I 对探针序列的标记切口平移法(nick translation )：放射性同位素标记：当存在dNTP时，DNA聚合酶 I 同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性。11253外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在缺口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。缺口缺口55335353113纯化的DNA片断DNase I制造单链缺口DNA Pol I进行切口转移一种-

37、32P-dNTP和dNTPs555555553333333332P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记1142. Klenow fragment具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性质DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶115 3端补平55klenow DNA 3末端标记补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途1163隐蔽末端的DNA片断Klenow fragment补平根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs末端标记的

38、DNA限制性内切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTTAA55-GAATT33-CTTAA55-G33-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h117 cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow533553引物118（1） T4 DNA聚合酶的性质3. T4 DNA聚合酶从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化，由噬菌体基因43编码。有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。 来源 酶活性119 特点A 当没有dNTP时，T4 DNA聚

39、合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。B 如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。C 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。12055335533T4 DNA聚合酶无dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs55121（2） T4 DNA聚合酶的用途标记末端（取代合成法或置换合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。 补平隐蔽末端 DNA 3末端标记122酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（35外切） DNA酶切片断T4 DNA聚

40、合酶（53聚合）55335533553355335533内切酶切无dNTPs123a. 放射性标记的优缺点：制作简单高比放射性放射自显影效果好优点：缺点：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存对人体有害要求在专门实验室操作124b. 非放射性标记i）生物素标记生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R可以与dNTP酰化结合成为biotin -1,6-dUTP、 biotin -1,4-dATP、 biotin -1,1-dUTP等。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。125纯化的DNA片断DNa

41、se I 制造单链缺口DNA Pol I 进行缺口转移biotin -dTTP和dNTPs5555555533333333生物素-dTTP生物素-dTTP利用切口转移法将生物素掺入DNA探针中126ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程，形成地高辛标记的DNA探针。生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒 (kit)。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。1274. T7 DNA聚合酶（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7噬菌体基因5编码的大亚基：T7噬菌体5蛋白。有53聚合酶和35外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋

42、白。增加大亚基对模板的亲和性。128（2）T7 DNA聚合酶的特点 持续合成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 35外切酶活性高单链和双链都能降解。 不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍129 进行末端标记 催化大分子量DNA为模板的合成如M13噬菌体 补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。1305. 修饰后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA测序双脱氧法。 标记DNA 3隐蔽末端 更有效地补平末

43、端1316. 逆转录酶最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。（2）AMV的性质由和两条多肽链组成，最适反应温度为4145132 链有反转录活性和 RNaseH活性。RNaseH：以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。RNaseHRNADNARNADNA133（3）逆转录酶的用途 链RNA-DNA杂交双链中53DNA外切酶活性。 合成cDNA以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。AAAAATTTTT

44、53mRNA 5cDNA134 合成DNA探针用随机引物（random primer）或oligo dT做引物。随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）135第四节 DNA修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶1. 来源小牛胸腺。2. 组成大小两个亚基。3. 特性53DNA聚合酶活性（terminal transferase）136 不需要模板！ 需要3OH、二甲胂酸缓冲液。 底物可以是单链DNA、是3OH突出的双链DNA、平末端需Co2+激活，但反应效率低。 随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。DNA 53TTTdTTP ，末端转移酶137

45、4. 末端转移酶的用途（1）同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。外源DNA载体DNA5353CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端转移酶138（2）再生酶切位点便于回收克隆片断。AAGCTTTTCGAA55Hind酶切ATTCGAAGCTT AKlenow补平139AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA AGCTTTTTTCGAA末端转移酶dTTPAAAAAA外源DNA140（3）DNA3OH末端标记AAGCTTTTTTCGA AGCTTTTTTCGAAAAAAAAHind位点Hind位点连接催化非放射性或放射性标

46、记物掺入DNA片断的3端。 （生物素-11-dUTP等）141二、T4多核苷酸激酶1. 来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2. 功能其激酶活性位于N端附近，磷酸酶活性位于C端附近。催化-磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。不论5-OH端突出与否。14253HO-OH53HO-OH3P-OH53HO-P5ATPT4多核苷酸激酶如果ATP的-磷酸带有32P标记，就可见被转移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。1433. 多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。53HO-OH53H

47、O-OH332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP多核苷酸激酶3P-OH53HO-P5碱性磷酸酶（1）正向反应（forward reaction）144（2）交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5端的磷酸交换。3P-OH53HO-P5332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。145 三、碱性磷酸酶1. 碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calf in

48、testinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。具有抗热性。SDS中加热68oC可完全失活。1462. 碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3P-OH53HO-P553HO-OH53HO-OH碱性磷酸酶3. 碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接147单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHind酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTT HO-A碱性磷酸酶555148A-OHTTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。同一酶切后的外源DNA的5端有P，能

49、与脱磷酸的载体OH连接。149ATTCGAAGCTT AAGCTTAATTCGA连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3P-AGCTTA-OH53HO-ATTCGA-P5外源DNA150第五节 核酸外切酶（ Exonucleases）是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。一、单链DNA外切酶1. 大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）53外切识别5-OH2. 大肠杆菌核酸外切酶（exo ）53、35外切识别3-OH、5-P151二、双链DNA外切酶1. 核酸外切酶（exo ）35外切识别3-OH主要用途：在DNA双链的末端产生出单链区域。5555exo 与klenow配合进行3端标记-OHHO-1522. 核酸外切酶（ exo）53外切。主要用途：使DNA双链变成单链（短）。5 P-P 555 exo 成为测序模板。识别5-P（但不能降解5-OH）1533. T7基因6核酸外切酶53外切。用途与 exo一样。既能识别5-P，又能识别