致病菌毒力基因的系统筛选方法课件

1、致病菌毒力基因的系统筛选方法微生物学教研室丛延gcong毒力基因的定义/标准一个基因或其产物可以在致病株中查见，而在非致病株中没有（或发生突变或不表达）；在致病株中失活该基因会减低其致病力；将该基因转到非致病株中表达会提高其致病力；在致病株感染过程中，该基因会被调控表达；针对该基因产物的体液免疫或细胞免疫具有保护性作用。柯赫原则的分子版本Falkow, S. (1988) Rev. Infect. Dis. 10, S274S276 Falkow, S.(2004) Nature Reviews Microbiology 2, 67-72 Wassenaar TM e

2、t al. (2001) FEMS Microbiol Lett. 201:1-7Trudy M. Wassenaar and Wim Gaastra. Bacterial virulence: can we draw the line? FEMS Microbiol Lett. 2001,201:1-7毒力基因的类别病原菌有多少毒力基因?对鼠伤寒沙门菌的估测方法：转座子随机突变标准：毒力减弱1000倍结果：毒力基因比例为4%和7% （腹腔注射和灌胃）Bowe F et al. At least four percent of the Salmonella typhimurium genome

3、 is required for fatal infection of mice. Infection and immunity1998;66(7):3372-7毒力基因的数量：200个已经确认：20%近年发展的毒力基因筛选技术根据突变株毒力变化：转座子随机突变技术标签标记的突变技术 Signature-tagged mutagenesis （STM）根据毒力基因表达调控特点：体内诱导性启动子筛选： 差异荧光诱导技术 Differential fluorescence induction （DFI） 体内表达技术 In vivo expression technology （IVET）转录水平

4、：基因芯片分析翻译水平： 体内诱导抗原鉴定技术 In vivo-induced antigen technology （IVIAT） 双向电泳一、什么是转座？转座(transposition)是指细菌的一段可移动的DNA片段，能在细菌的染色体、质粒和噬菌体内部或之间自行移动。Transposable Genetic Element(转座因子)Transposon（转座子）Jumping gene（跳跃基因）Donor siteTarget site转座特点：转座因子是基因组正常组分，以相对独立的序列结构存在于染色体、质粒或者噬菌体中。转座的发生不依赖于转座因子和靶位点之间任何的序列同源性。原核

5、生物和真核生物均有转座因子。转座可造成遗传学效应。Ac / Ds Transposons in MaizeDissociation transposonpurple color geneActivator transposon 转座现象广泛存在玉米基因组的20亿个碱基对中，其中转座因子就占了一半以上转座子广泛存在于从病毒、细菌到真核的高等动植物细胞中人类基因组中转座序列在35以上三、细菌转座元件的类别插入序列（ Insertion Sequence ）类插入序列（IS-like element）复合转座子（Composite Transposon）TnA家族转座噬菌体 （Mu Bacterio

6、phage）每种IS元件具有不同序列，但有共同的组织形式插入序列IS1的结构（三） 复合转座子 Composite Transposon命名：通常以Tn加上数字表示，如Tn903。结构: 1. 两侧重复顺序就是IS或者类IS。 2. 除转座酶基因外还有其它表型基因， 如：耐药基因，使宿主具表型效应。IS ISIS IS L IS R臂 中心区 臂transpositionTn1681大肠杆菌热稳定毒素I 基因552 bpIRIRIRIR复合转座子结构示意图IS1IS1（四） TnA家族：两端为IR（Inverted repeats）而非IS中间的编码区不仅编码抗性标志，还编码转座酶和解离酶；进

7、行复制性转座，分为两步，分别由转座酶和解离酶完成。如：Tn3和Tn1000（五）转座噬菌体 Mu Bacteriophage（巨型转座子 ）噬菌体 Mu是一个特殊的噬菌体，可以感染大肠杆菌；有裂解和溶原两个生活周期；Mu前噬菌体整合到宿主染色体上的方式不是位点特异性重组，而是随机的转座机制。 随着噬菌体的复制，新的拷贝以复制转座方式随机插入到宿主菌染色体各处不同位置。 1 非复制性转座（nonreplicative transposition）这类转座因子直接从原位点移到靶位点，同时在供体留下产生一个双链断裂的位点，这种类型的机制只需要转座酶，这个双链断裂位点需要修复系统的识别和修复。 转座子

8、作为可移动的元件被复制，一个拷贝保留在供体原来的部位不变；另一个拷贝则插入到受体的位点上，结果供体和受体都有一个转座子的拷贝。2 复制性转座（replicative transposition）：转座子的应用：转座子除了它本身的遗传学效应外，在许多方面是遗传学研究中的一个有用的工具。如在插入突变、作为基因转导的供体、基因定位的标记、菌株构建、基因克隆等方面都可利用转座子作为工具。 五、细菌转座子的应用致突变的工具，用于研究细菌基因的功能高通量地筛选与某种特定功能有关的基因快速构建细菌完整的单基因突变株库STM法系统筛选病原菌的毒力基因应用举例1高通量地筛选与某种特定功能有关的基因Infecti

9、on and Immunity, August 2004, p. 4888-4890, Vol. 72, No. 80019-9567/04/$08.00+0 DOI: 10.1128/IAI.72.8.4888-4890.2004Copyright 2004, American Society for Microbiology. All Rights Reserved. Biofilm Formation In Vitro and Virulence In Vivo of Mutants of Klebsiella pneumoniae Heather F. Lavender, Jennif

10、er R. Jagnow, and Steven Clegg* Department of Microbiology, College of Medicine, University of Iowa, Iowa City, Iowa 52242构建克雷伯菌的转座突变株库检测突变株的生物膜形成能力发现部分突变株不能形成生物膜研究路线对突变基因进行定位对突变株的体内毒力进行检测构建转座突变株库大肠杆菌 SM10(pir)：pUT Mini-Tn5 (含转座子片段) Km r Rif s 肺炎克雷伯菌43816 Km s Rif r自杀质粒通过接合方式传递质粒发生转座双抗平板筛选肺炎克雷伯菌4381

11、6的转座突变株1 tnp: transposase 转座酶2 反向重复序列，Km耐药基因3 ori R6K:复制起点，只能在表达蛋白 的细菌中复制。 （成为自杀质粒） 在大肠杆菌SM10(pir)中复制4 mob RP4:编码与接合有关的酶，使质粒 通过接合方式传递给受体菌。质粒pUT Mini-Tn5的构成大肠杆菌肺炎克雷伯菌K. pneumoniae: Kms Rif r无转座K. pneumoniae : Km r Rif r发生转座突 变 株质粒上的转座序列细菌染色体上的基因ACBACB(基因失活)转座细菌突变株生物膜形成能力的检测 localization of the mutati

12、on genes P2P1P1P2TnP1P2Restriction siteRestriction siteChromosomal DNA digested with a restriction enzyme Self-ligation and inverse PCR (I-PCR)Sequencing the resulted PCR product反向StrainSite of Tn insertionBiofilm in vitroaVirulence in vivob43816+MBM100yadH+MHV1yciIHFL100yhdH+HFL101pduA (+)c+实验发现：转座

13、子的优点与普通诱变法如亚硝基胍诱变、紫外线照射诱变比较：诱变率较高。导致插入性单突变，不会出现化学诱变常出现的多重突变，有利于研究的准确。插入序列已知，便于对失活基因定位。 转座子的优点与基因敲除法比较：高通量；操作简单；适用于与某种功能有关的未知基因的筛选；而基因敲除则是对某一比较确定的基因进行操作（至少知道序列）。转座子随机突变技术的缺点不同细菌可能需要不同的转座子，且转座子在基因组中插入方式必须是随机的；有可能产生极效应，需要确证实验；需要合适的筛选模型，操作应简单；讨论如何寻找S. suis 2型强毒株的黏附相关基因？选择转座子：Tn917Tn917随机插入诱变与血管内皮细胞进行细胞黏

14、附实验，筛 选突变株定位突变基因同源重组构建同一基因敲除株和回补实验确认 应用举例2快速构建完整单基因突变株库铜绿假单胞菌PA14的转座突变株库的建立PA14 genome is made up of approximately 5,500 non-essential genesBy Nicole T. Liberati, Dan G. Lee, Jacinto M. Villanueva and Frederick M. AusubelDepartment of Molecular BiologyMassachusetts General Hospital两种转座子，避免插入的热区流程示意图

15、转座获得突变株随机引物PCR扩增突变基因序列突变株库的筛选规模The PA14 Transposon Insertion Mutant Database (/cgi-bin/pa14/mutants/retrieve.cgi)应用举例3 STM法筛选病原菌毒力基因STM(signature tagged mutagenesis)标签标记突变技术(STM）系统筛选细菌毒力基因的高通量方法转座技术的改进Ficht TA et al. 2010.Methods Mol Biol;634:15-35.KmMini-Tn5 transposonVariable region (40 bp)Invaria

16、ble arm(20 bp)Invariable arm(20 bp)Primer FPrimer RTag 1Tag 3Tag 4Tag 5Tag 6Tag 2A pool of mutants with different tagsFicht TA et al. 2010.Methods Mol Biol;634:15-35.Input poolRecovered poolNegative selectionColony hybridizationFicht TA et al. 2010.Methods Mol Biol;634:15-35.Results of colony hybrid

17、izationInputRecoveredRecoveredRecovered第二节 体内诱导基因的筛选技术体内诱导基因：病原菌在宿主体内表达而在体外不表达的功能基因，称为 。(in vivo-induced gene, IVI gene)在体内特异性表达的基因和细菌在宿主体内生存、致病过程关系密切毒力基因（广义）筛选体内诱导基因的方法筛选具有体内诱导活性的启动子：差异荧光诱导技术 Differential fluorescence induction （DFI）体内表达技术 In vivo expression technology （IVET）比较体内外环境中基因转录水平差异：基因芯片分析

18、比较体内外环境中基因表达水平差异：体内诱导抗原鉴定技术 In vivo-induced antigen technology （IVIAT）蛋白质双向电泳 two-dimensional electrophoresis technology 差异荧光诱导技术 (DFI) / 体内表达技术 (IVET)基因的表达是通过启动子进行调控；启动子的活性决定了基因的表达；筛选到体内诱导的启动子就相当于筛选到体内诱导基因。Promoterivi gene差异荧光诱导技术 (DFI)构建携带绿色荧光蛋白基因gfp(无启动子)的质粒； 在gfp基因前面插入致病菌随机的DNA片段；将质粒转入致病菌； 体外培养后

19、，用流式细胞仪筛选出不发荧光的致病菌；筛选出的致病菌感染宿主细胞；用流式细胞仪筛选出发荧光的致病菌； 质粒测序，确定启动子及其调节的体内诱导基因pathogenFACSin vitroin vivoFACSgfpDifferential fluorescence induction (DFI)优势:- 高通量- 可以检测上调或下调表达的基因- 灵活性:可以测试多种条件下的表达缺陷:- 以细胞模型模拟体内研究，不能反映致病菌致病机制的全部环节In vivo expression technology (IVET)致病菌在体内生长需要一个关键生长因子 essential growth factor

20、 (egf)；质粒携带egf选择标志和lacZ报告基因（无启动子）在egf / lacZ 基因前面的多克隆位点插入致病菌随机的DNA片段将质粒转入致病菌中；将致病菌感染小鼠； 从感染小鼠体内组织分离致病菌；在平板上蓝白筛选，筛选白色菌落（ no -galactosidase activity）质粒测序，确定启动子及其调节的体内诱导基因PathogenmutantegflacZin vivoin vitrowhite colonies carryin vivo induced promotors肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae CG43体内诱导基因的筛选Klebsiella

21、 pneumoniae CG43 ：是一个galU 基因的突变株。galU基因编码 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，控制UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的合成，二者是合成荚膜多糖(CPS) 和脂多糖(LPS)的主要成分。细菌发生galU 基因突变后，就无法在动物体内生存。而且不能分解半乳糖，在麦康凯培养基上产生无色菌落，可以和带有 galU 基因的菌株相区分（粉红色菌落）。Infection and Immunity 2001the promoterless galU gene as a dual-function reporter筛选策略体外培养体内实验体内诱导启动子Ivi genePredicte

22、d protein iucA (1073533)Aerobactin biosynthesisfepA (P05825)Ferrienterobactin receptor ptfA (P24217)Phosphotransferase system uup (P43672)ATP-binding cassette transporter tdcA (P11036)Tdc operon transcriptional activator rbsR (P44329)Ribose operon repressor lysA (P455170)Diaminopimelate decarboxylas

23、e yaeM (P45568)1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase gyrA (P09097)DNA gyrase subunit A ppiA (P20753)Peptidylprolyl cis-trans isomerase A yjjB (P18389)Protein P-14 ydgH (P76177)Protein YdgH precursor yjjZ (P55914)Hypothetical 8.7-kDa protein yhgI (P46846)Protein YhgI yfjB (P37768)Hypothetic

24、al 32.6-kDa protein yfaE (P37910)Hypothetical 9.3-kDa protein yjcC (P32701)Hypothetical 60.8-kDa protein KPN_CONTIG 880Unknown KPN_CONTIG 765Unknown Novel sequenceUnknownIVET是最佳的筛选体内诱导基因的方法。但IVET方法需要动物模型，不适用于没有动物模型的致病菌研究，例如伤寒沙门菌只对人致病，采用IVET方法就无法进行研究。体内诱导抗原鉴别技术（In vivo induced antigen technology，IVIA

25、T）IVIAT法的技术路线图pET30a/b/c载体系统示意图 该系统由3个质粒构成，相对于BamH克隆位点识别序列GGATCC的阅读框，带后缀a的载体从GGA三联密码子开始表达，带b的从GAT开始，带c的从ATC三联密码子开始表达。一段基因组DNA插入到这三个表达载体后，能保证在其中一个阅读框是正确的，从而在诱导表达后获得一个序列正确的蛋白。Fig. 2. Screening of IVI antigens of S.enterica serovar Typhi strain Ty2 using IVIAT. (A) One of the reactive clones (indicated

26、 by the black arrow) identified in the first screen. reactive cloneTable 2. S.enterica serovar Typhi strain Ty2 antigens identified by IVIAT Gene designation in S. enterica serovar Typhi strain Ty2 genome sequencefunctiont0025fimbrial structural subunit t3816Rhodanese-related sulfurtransferaset3817Glutaredoxin and related proteins t1497Outer membrane TonB dependent receptor proteins, mostly Fe transport t1598ABC-type transport systems, permease components t3663ABC-type uncharacterized transport system t3689hypothetical protein IVIAT法的优缺点优点缺点不需要感染模型，但需要病人血