蛋白质糖基化的研究及进展课件

1、蛋白质糖基化的研究及进展1 概 述1988年，牛津大学的 Raymond Dwek 在 Annual Review of Biochemistry上发表题为 “糖生物学”的综述，标志糖生物学这一前沿领域的诞生。美国的新罕布什大学 首先开展了“糖组学”（glycomics) 的研究美国于2001年正式启动了“功能糖组学”的研究“功能糖组学” 研究目标 基因组计划提供了基本的遗传信息，而许多基因的功能仍需要阐明。其中的关键就是蛋白质的翻译后修饰，而糖基化是最主要的翻译后修饰之一。阐明由蛋白质-糖链所介导的细胞通讯机制糖组学研究的重心便是蛋白质糖基化的研究。蛋白质糖基化研究的基本目标是：寻找编码糖蛋

2、白的基因寻找糖基化位点解析糖链及糖基化肽段的结构研究糖基化的功能基因组信息糖基化位点信息结构信息功能信息现代分子生物学的中心法则：糖链的多样性和复杂性“连接方式异构体”“分枝形成”2 蛋白质糖基化的分类1O-糖基化: 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr 等侧链的羟基处2N-糖基化: 糖链连接在蛋白质的Asn的氨基侧链处3GPI-Anchor糖基化: 蛋白质通过肽链的C端共价连接 的 糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上。蛋白质糖基化的研究策略1.凝胶技术与质谱联用2.非凝胶技术与质谱联用3.O-GlcNAc 糖基化研究细胞组织双向电泳切割酶切质谱分析 糖链鉴定 数据库搜索 靶蛋白鉴定及功能

3、分析与磷酸化之间存在“阴阳”关系 可以被筛选和鉴定O-GlcNA pr亲和层析母离子扫描 366数据库搜索 鉴定4 糖基化蛋白质的分离技术蛋白质混合物 分离纯化糖蛋白 糖肽 凝集素 ConA 是一种典型的对于一系列高甘露糖型的N-连接糖链具有高亲和性的植物凝集素， 同时也能结合复杂型的N-连接糖链及双分枝的复杂型的N-连接糖链Mana1-6(Mana1-3)Man较强Mana1-2Mana1-6 (Mana1-3)Man最强缺少三甘露糖核心结构或含有阻碍性的3-OH，6-OH取代基团的Mana（1-6）较弱 Galectin LEC-6 PNA 半乳糖苷结合凝集素是一类分布广泛，不依赖于金属离

4、子的可溶性凝集素 很多生物具有保守性 倾向于结合包含半乳糖且具有分枝结构的N-连接糖链花生凝集素是组织化学中用于检测T抗原的。 T抗原在黏蛋白中广泛存在（如血型糖蛋白A） 可广泛结合于存在O-连接糖链的T抗原上2 与凝集素联用的检测方法 蛋白质印迹到膜上后，与标记了地高辛的凝集素一起孵育，再通过与带有碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合，最后加入显色试剂进行检测。6 质谱在蛋白质糖基化研究中的应用1 位点分析 a 特征离子检测 寻找糖基特征离子，进而确定糖肽 如 NacGlc 特征离子为 m/z 204 b 酶处理前后酶解肽谱比对 在TIC图上，酶解前的糖肽峰酶解后消失，出现去糖肽， 根据去糖肽的相对

5、分子量及MS/MS图确定糖基化位点Q-TOF-MS 高分辨 高灵敏度 高精确度 母离子扫描 HexNAc+ (m/z 204) HexHexNAc + (m/z366)MALDI-TOF-MS 能方便的检测出衍生或未衍生的寡糖 可以直接分析分子质量较大的糖蛋白，并分辨不均一性展 望 由于糖蛋白本身的复杂性，蛋白质糖基化的研究必须采取多元化的研究策略和技术，而各种新的检测方法也不断的被采用。 随着各种分离技术的不断发展，研究方法也不断翻新。蛋白质糖基化研究也将成为翻译后修饰研究的新热点主要参考文献1 夏其昌 曾嵘等 蛋白质化学与蛋白质组学 科学出版社 20042 Hirabayashi J ,e

6、tc JCB 2002,771(1-2):67-873 Hirabayashi J ,etc Trends Glycosci Glyco ,2000,20(6):286-2874 Courtenay Hart etc Electrophoresis 2003, 24, 5885985 Cristian I. Ruse etc Anal. Chem.2002, 74,1658-16646 STEVEN A etc Protein Science (1993), 2, 183-196.7 Benjamin L. etc Anal. Chem.2002, 74,6088-60978 Wei Li,etc Anal. Chem.2002, 74,5701-57109 Rong Zeng,etc Eur. J. Biochem. 266, 352-358 (1999)10 Pauline M.etc Proteomics 2001, 1, 28529411Schulz BL etc Anal Chem,2002,74:6088-609712Robbe C, etc Biochem J 2004 Dec1 ; 384：307-16 13Suzuki ,etc, Anal Chem, 2006 Apr 1;78(7):223