靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定

1、靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定【摘要】目的构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。方法针对ylinE基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilener2.1-U6-ne质粒，构建ylinEshRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染F-7细胞株，应用esternblt检测ylinE蛋白的表达。结果酶切和测序结果显示，成功构建特异性针对ylinE的shRNA表达质粒。转染F-7细胞后下调ylinE的表达。结论成功构建靶向ylinE的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术进展肿瘤基因治疗的研究提供实验基矗【关键词】细胞周期蛋白E短发卡构造状RN

2、ARNA干扰nstrutinandIdentifiatinfshRNAExpressinVetrSpeififrylinEAbstrat:PurpseTnstruttheshrthairpinRNAshRNAexpressinvetrspeififrylinE.ethdslignuletideseredesignedspeififrylinEgene,afterannealingthefredduble-strandedDNAsereligatedithPsilener2.1-U6-ne.TheexpressinvetrsfPsilener2.1-U6/shRNAereidentifiedby

3、enzyedigestinandsequeneanalysisandtransfetedintF-7ells.TheexpressinfylinEasanalyzedbyesternblt.ResultsThevetrasidentifiedbyrestritinenzyedigestinandsequeneanalysis,theexpressinvetrsfPsilener2.1-U6/shRNAassuessfullynstruted.TheexpressinfF-7ellsylinEexpressinlevelassuppressedaftertransfetinithylinEshR

4、NAvetr.nlusinThePsilener2.1-U6/shRNAspeififrylinEissuessfullynstrutedanditillprvideexperientalbasisfranergenetherapybyRNAitehnique.Keyrds:ylinE;shrthairpinRNA;RNAinterferene肿瘤是一类细胞周期性疾病，细胞生长周期的失调在肿瘤的发生开展中起关键作用。ylinE高表达可以缩短G1期，引起中心体过增殖，扰乱有丝分裂，形成不稳定的染色体，从而诱发肿瘤1。已有研究提示，ylinE在白血并乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤等多种肿瘤中过表达2，因此

5、，ylinE有望成为肿瘤基因治疗的新靶点。RNA干扰(RNAinterferene，RNAi)技术是一种能阻断目的基因表达的有效方法3。本研究设计了靶向ylinE的短发卡构造状RNA(shrthairpinRNA，shRNA)，利用载体质粒Psilener2.1-U6-ne构建产生shRNA，为今后将其进一步应用于ylinE的靶向治疗研究奠定了基矗1材料与方法1.1材料DE培养基、胰蛋白酶、E.liDH5、脂质体转染试剂LIPFETAINE2000REAGENT(Invitrgen)、胎牛血清(杭州四季青生物材料)，鼠抗人ylinE多克隆抗体、HRP标记的兔抗鼠IgG为Santaruz公司产品

6、、SupersignalestpiTrialKit为PIERE公司产品，小量质粒提取试剂盒中鼎公司、Psilener2.1-U6-ne表达载体Abin公司，T4DNALigase、BaH、Hind、SalNEB公司，F-7细胞株浙江大学医学院病理教研室惠赠，半干转膜仪BI-RAD。1.2实验方法1.2.1shRNA表达载体的构建分别合成编码发夹构造shRNA的正义链和反义链，构造如下：BaH+Sense+Lp+Antisense+终止信号+Sal+Hind，针对ylinE基因的序列为：P1:5-GATGATTTTTTGAGGTATATTAAG-AGTATAGGTAAAGAAATTTTTTTGT

7、GAA-3，P2:3-GTAAAGAAATGGATATAAGTTTG-ATATGGAGTTTTTTAGAAAAAAAGTGTTGA-5，对照shRNA的序列为：P1:5-GATGATT-ATAAGGGATGTTAAGAGGATGGTTATGAAGTTTTTTTGTGAA-3，P2:3GTG-AAGTATTGGTAGAAGTTTGGTAG-GGAATATTAGAAAAAAAGTGTTGA-5。分别取2l正反义寡核苷酸(终浓度均为25l/L)，16l退火缓冲液(200l/LNal，20l/LTris)，94水浴5in，然后自然冷却至室温。将退火后的双链siRNA模板与Psilener2.1-U6-

8、ne质粒表达载体于16连接过夜。以连接产物转化E.liDH5感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上挑选重组载体。从每个培养皿上各挑取3个单菌落接种于3l含Apr抗性终浓度为50g/l的LB培养液中，37恒温摇床250r/in培养过夜。用试剂盒小量提取质粒，并分别用Sal做酶切鉴定。搜集酶切鉴定正确的重组质粒，进展DNA测序。1.2.2细胞培养及siRNA转染F-7细胞培养体系为含10%胎牛血清的DE培养基，37、5%2培养。转染24h前，传代至6孔培养板，每孔2.5105个细胞。实验分空白组、对照组和siRNA实验组。空白组不经任何处理，对照组转染阴性对照shRNA表达载体1g，实验组转染shRN

9、A-ylinE表达载体1g。用LIPFETAINE2000脂质体转染试剂进展转染，于37、5%2转染48h后，收获细胞。1.2.3esternBlt检测ylinE蛋白表达搜集转染的细胞，加细胞裂解液(1%NP40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，1l/LPSF，100l/LLeupeptin，1l/LNa3V4)裂解，10kg10in离心搜集上清液，Bradfrd法测蛋白含量。取25g蛋白进展SDS电泳，转PVDF膜BI-RAD半干转膜，24V、24in，鼠抗人ylinE(11000)，二抗(17000)，SupersignalestpiTrialKit显色。同时检测Atin蛋白表达，作为

10、内参照。2结果2.1shRNA重组质粒的构建及鉴定将提取的质粒用Sal做酶切鉴定。经酶切鉴定：质粒Psilene2.1-U6-ne序列里面是没有Sal的酶切位点的，而在我们的插入序列里面设计了Sal的酶切位点，假如插入正确，就应该可以被Sal所酶切；而重组质粒能被Sal酶切，即为插入正确的质粒。测序结果显示，特异性针对ylinE的shRNA载体构建成功。见图1、2。2.2siRNA转染后ylinE蛋白表达的变化shRNA-ylinE表达载体转染48h后，分别提取转染shRNA-ylinE和对照shRNA表达载体的细胞总蛋白做esternblt分析。与对照组相比，转染shRNA-ylinE后，y

11、linE蛋白表达明显降低。3讨论RNAi是最近开展起来的一种抑制特定基因表达的新方法，在基因组功能分析领域已经成为强有力的工具，并且随着在哺乳动物细胞内的进一步应用，人们已经开场关注RNAi作为一种基因治疗手段的潜力。多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶启动子(pl)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(shrthairpinRNA，shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pl启动子下游。与直接导入化学合成的siRNA相比，这种技术由于涉及到克隆，

12、这个过程需要较长时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的，但是操作简便，本钱低，而且质粒导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效率高6。另外我们选择的Psilener2.1-U6-ne真核表达载体带有ne的选择标记，通过G418抗生素挑选，能挑选出表达shRNA的细胞，用于长期的基因功能研究。ylinE是一种细胞周期蛋白，在G1/S期的过渡时期进展积累，调控细胞进入S期，之后被泛肽介导的蛋白酶解途径降解。假如ylinE的降解途径发生缺陷的话，就会导致细胞进入S期加速，细胞的遗传就会不稳定，以致发生癌变。大量研究说明ylinE在肿瘤的发生中起到重要作用,也能为大量常见的肿瘤提供预

13、后信息7，8，同时ylinE高表达也是肿瘤耐药的机制之一9。本实验以ylinE为靶标，设计siRNA序列，并构建其表达质粒Psilene2.1-U6表达shRNA-ylinE，酶切和测序结果显示，特异性针对ylinE的shRNA载体构建成功；转染乳腺癌F-7细胞后，使ylinE表达明显下降，成功构建靶向ylinE的shRNA真核表达载体，为RNAi在肿瘤ylinE靶向基因治疗研究，提供了重要实验根底，我们也将进一步利用ylinE的shRNA载体，进展肿瘤基因治疗的体内外实验。【参考文献】1SprukH,nKA,ReedSI.DeregulatedylinEindueshrseinstabili

14、tyJ.Nature,1999,401(6750):297-300.2ShralP,Buher,BissigH,etal.ylinEverexpressinandaplifiatininhuantuursJ.JPathl,2022,200(3):375-382.3YuJY,DeRuiterSL,TurnerDL.RNAinterferenebyexpressinfshrt-interferingRNAsandhairpinRNAsinaalianellsJ.PrNatlAadSiUSA,2002,99(9):6047-6052.4assagueJ.G1ell-ylentrlandanerJ.Nature,2022,432(7015):298-306.5DeshpandeA,SiinskiP,HindsP.ylinsandDKsindevelpentandaner: