酶作用机制和酶调节(2)PPT

1、关于酶的作用机制和酶的调节 (2)第一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月酶的活性中心影响酶催化效率的因素酶催化反应机制的实例酶的活性调节同工酶和多酶体系酶作用机制和酶的调节第二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月一、酶的活性中心（active center） 1、概念对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团，它们在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕，折叠而在空间构象上相互靠近；对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或其某一部分往往就是活性中心的组成部分。第三张，PPT共五十九页，创作于2022年6

2、月2、活性中心的功能部位结合部位：一定的底物靠此部位结合到酶分子上；催化部位：底物的键在此部位被打断或形成新的键，从而发生一定的化学变化。 第四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月3、酶活性部位的特点活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分：往往只由几个氨基酸残基组成；酶的活性部位是一个三维实体：活性部位的三维结构是由酶的一级结构所决定的。活性部位的氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，但在肽链的盘绕、折叠而在空间结构上相互靠近；酶活性部位是一个疏水区域：酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝，这是相当疏水的区域，非极性基团较多，产生一个微环境，此裂缝内的底物浓度相当高，从而提高了与底物的

3、结合能力；而其内少量的极性氨基酸残基可与底物结合而发生催化作用；第五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月诱导契合是一个动态的辨认过程：酶的活性部位与底物结合中，酶与底物的构象发生变化后互补，即诱导契合是一个动态的辨认过程。底物通过次级键较弱的力结合到酶上：酶与底物结合成ES复合物，主要作用力为次级键（氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用）；酶活性部位具有柔性或可运动性。第六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月4.研究酶活性部位的方法(1)、侧链基团化学修饰非特异性共价修饰: 某些化学试剂与酶蛋白中某些氨基酸残基特异性共价结合或者氧化、还原，使基团结构和性质改变。可被化学修饰的基团很多

4、，例如巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基、胍基等。化学试剂已经与活性部位结合标准： 酶活性丧失程度与化学试剂剂量成一定比例关系底物或者可逆抑制剂的加入阻断了化学试剂对酶的修饰E-Cys-SH +4. 研究酶活性部位的方法第七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月特异性共价修饰： 利用某一化学试剂特异性与酶活中心某一氨基酸结合后，使酶失活。如：胰凝乳蛋白酶活性中心之外有27个Ser残基，但二异丙基氟磷酸（DFP)专一修饰胰凝乳蛋白酶活性中心的 Ser。因为活性中心的Ser处于一个特殊的结构中对DFP敏感。二异丙基氟磷酸第八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月R对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯(

5、TPE)对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）DFP二异丙基氟磷酸亲和标记法：修饰剂与底物结构相似，并利用酶对底物的特殊亲和力进入酶的活性位点。胰凝乳蛋白酶2. 定点诱变利用定点改变编码蛋白质基因的DNA序列，研究酶活性部位的必需氨基酸。His57发生烷基化第九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月溶菌酶红色为底物；蓝色为Glu35 & Asp523. X 射线晶体结构分析法第十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月二、酶催化反应的独特性质酶反应主要分为两类：一类仅涉及电子转移，另一类涉及到电子和质子或者其他基团的转移。大部分酶催化反应属于第二类由氨基酸侧链的功能基团和辅酶为媒介

6、，例如 His、Ser、Cys、Lys等；最适合pH范围窄酶分子很大，而活性部位很小，但是巨大的酶结构对稳定酶活性部分的构象不可少酶催化的反应远超过简单的催化剂范畴： 活性部位具有1个以上的催化基团,所以可以协同催化 存在特异的底物结合部位 随着底物数量的增加，底物结合部位数量也相应改变 底物以某种方式结合到酶上，使底物分子中的键产生张力， 有利于过渡态复合物的形成第十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月三、影响酶催化效率的因素（一）底物和酶的邻近效应和定向效应邻近效应：分子间反应分子内反应，催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大地升高，从而使反应速率大大增加。咪唑催化乙

7、酸对硝基苯酯，反应速率慢变为分子内反应后，反应速率快了24倍第十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（2）定向效应指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向。当底物与活性中心结合时，酶蛋白经诱导而发生构象变化，底物反应部位（基团或键）与酶的催化部位发生楔合，即“定向”作用，使酶促反应具有高效率和专一性特点。邻羟苯丙酸中，由于两个甲基的取代，迫使羧基与羟基之间能更好的定向，反应速率提高了2.5 1011倍。第十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月2、底物的形变和诱导契合 底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变” ，产生“电子张力

8、”而引起敏感键的一端更加敏感，使底物比较接近它的过渡态，形成一个相互契合的酶-底复合物，进一步转换成过渡态，降低反应活化能，大大提高酶促反应速度。第十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月3、酸碱催化酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸碱催化方式。广义酸碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。 广义酸基团（质子供体） 广义碱基团（质子受体）第十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 酶活性中心上有的基团是质子供体，有的为质子受体，均可进行催化作用。第十六张，PPT共五十九页，

9、创作于2022年6月酶蛋白中起广义酸碱催化作用的功能基：氨基、羰基、羧基、硫氢基、酚羟基和咪唑基。组氨酸的咪唑基：既是很强的亲核基团，又是有效的广义酸碱功能基。1）其解离常数约6.0，即其解离下来的质子浓度与水中的H+相近，所以在中性条件下，有一半以酸形式存在，另一半以碱形式存在，即可作为质子供体，又可作质子受体而在酶反应中起催化作用；2）其供出和接受质子的速度十分迅速，且供出和接受的速度相等。 第十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月4、共价催化又称亲核、亲电催化：催化时亲核催化剂或亲电催化剂分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电子中心，迅速形成不稳定共价中间复合物，降

10、低反应活化能，加速反应，称为共价催化；酶的亲核基团（如羟基、巯基）对底物的亲电子中心进行攻击。亲核基团含有可提供电子的原子，向底物亲电子的原子提供电子，由此形成不稳定的共价中间物。但酶的亲核基团易变，所形成的共价中间物不稳定，随后会被水分子或第二种底物攻击而给出所需的产物，由此可加快中间物的分解而释放出产物。第十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月酶蛋白分子上的主要亲核基团：Ser的的羟基、 Cys 的硫基、 His 的咪唑基、Asp 的羧基。某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。第十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月5、金属离子催化（1）金属离子催化

11、：大部分酶的催化活性需要金属离子的参与。（2）分类金属酶:金属离子作为酶的辅基，多是过渡态金属离子，例如Fe2+, Fe3+, Mn2+等金属激活酶：金属离子作为酶的激活剂，多是碱和碱土金属离子例如Na+， K+， Mg2+, Ca2+等（3）机理 通过结合底物为反应定向； 通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应； 通过静电稳定或屏蔽负电荷。第二十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月6、活性部位微环境的影响 某些酶的活性中心穴内相对是非极性的，催化基团被低介电环境包围，并排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力。 水会减弱极性基团间的相互作用

12、。水的极性和形成氢键的能力很大，水的介电常数极高。这种高极性使它在离子外形成定向的溶剂层，产生自身的电场，从而大大减少了它所所包围的离子间的静电作用或氢键作用。第二十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月三、酶催化反应机制的实例1、溶菌酶 溶菌酶的生物学功能是催化细菌细胞壁多糖的水解。（1）细胞壁多糖：N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸（NAM）的共聚物，NAG与NAM以-1,4糖苷键交替排列。 第二十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月溶菌酶14.6 103 Da, 129aa, 4个S-S键N-乙酰胞璧酸N-乙酰葡萄糖胺催化水解NAM的C1与NAG的C4之间

13、、NAG之间的（1-4）的糖苷键，但不能水解NAG 的C1和NAM 的C4之间的（1-4）糖苷键第二十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月NAG 寡聚体长度溶菌酶相对水解速率溶菌酶活性部位的容量6个糖残基第二十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月溶菌酶分子中有一个狭长的凹穴，正适合于6个糖残基的嵌合。凹穴中的Glu35和Asp52是活性中心的氨基酸残基。第二十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月溶菌酶的催化机制Glu提供一个H+到D-E环之间的糖苷键O上，使之断开Asp通过带有负电荷的羧基稳定D环的正碳离子中间产物Glu35由于处于非极性区，呈不解离状态-COOH，这样

14、它可以起着广义酸作用，提供一个质子给糖苷键的氧原子，使得氧原子与D环C1间的糖苷键断开，而C1带上正电荷，成为正碳原子C1+。处于极性区的Asp52在通常情况下呈离子化状态-COO-，这样它就起着稳定C1+的作用，协调C1-O间糖苷键的断裂，直到环境中水分子的OH-与C1+结合，H+与Glu35结合，使两者恢复非离子化形式。由此完成一次水解反应 。第二十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月2. 胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一类最有特色的酶家族，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂和其他酶类。其中，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶在胰

15、腺中合成，以非活性形式分泌到消化道中，并在其中经过去除部分肽段成为活性酶。这三种酶由同一祖先“趋异进化”，都负责裂解肽键，作用机制相似、专一性不同。具有His、Asp、Ser组成的“催化三联体”。活性部位位于疏水口袋。第二十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月2、胰凝乳蛋白酶(1)专胰凝乳蛋白酶隶属丝氨酸蛋白酶家族，在胰腺中合成，选择性裂解芳香氨基酸，例如Phe和Tyr。具有His57-Asp102-Ser195 催化三联体.第二十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（2）胰凝乳蛋白酶的活性中心 由Ser195、His57和Asp102组成，其中Ser195是酶活性中心的底物结

16、合部位，His57是活性中心内的催化部位，在三维结构中这三个氨基酸残基是十分靠近的。 第二十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（3）胰凝乳蛋白酶作用原理 活性中心的Ser195、His57及Asp102构成一个氢键体系，使His57的咪唑基成为Asp102羧基及Ser195羟基间的桥梁，Ser195由于His57及Asp102的影响而成为很强的亲核基团，易于提供电子。这个氢键体系称为“电荷中继网”。 第三十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月在大部分情况下，网中Asp102以离子化形式-COO-，Ser195以非离子化形式-CH2OH存在；但也有另一种情况，即由于Asp102从

17、Ser195吸引一个质子所造成，象接力赛跑那样，质子先从Ser195传递到His57上，再由His57传递到Asp102上。在此酶促反应中，His57咪唑基起着广义酸碱催化作用：先促进Ser195的羟基亲核地附着到底物敏感肽键的羰基碳原子上，形成共价的酰化中间物，再促进酰化的ES中间物上的酰基转移到水或其他的酰基受体（如醇，氨基酸等）上。其对多肽底物水解可分两个阶段：第三十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月胰凝乳蛋白酶作用机制 A、水解反应的酰化阶段：Ser195羟基的氧原子对底物敏感键的羰基碳原子进行亲核攻击，形成了一个为时暂短的四联体过渡态。在这过渡态中，底物的酰基部分与Ser1

18、95的羟基、氨基部分与His57的咪唑基相连接。在此过程中，通过电荷中继网（丝氨酸向组氨酸提供质子）发生反应，敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与His57咪唑基相连，底物的羧基部分通过酯键与Ser195的羟基相连。 第三十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 B、水解反应的脱酰阶段：首先胺从酶上释放出来，这样底物的羧基部分与酶就成了酰化酶，这是中间复合物。接着水分子进入活性中心，电荷中继网从水中吸收一个质子，结果OH-立即攻击已连在Ser195上的底物羧基碳原子，也形成一个短暂的四联体过渡态。然后His57供出一个质子到Ser195的氧原子上，结果底物中的酸成分从Ser195上释放

19、出来，酶又恢复自由状态。第三十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月3、羧肽酶（1）此酶是单链蛋白质，其中紧密地结合着一个Zn2+离子。这个离子对酶的活性很重要。该酶是一个外肽酶，催化肽链C-末端的肽键水解。第三十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月在酶的三维结构中，Zn2+离子处于接近酶表面的沟槽中，它与两个组氨酸（His196, 69）侧链和一个谷氨酸（Glu72）的连个羧基氧及一个水分子形成5个配位键。第三十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月离Zn2+离子不远有一个“裂缝”（见下图），允许底物C-末端伸入。裂缝顶部还有一个口袋，可以接受C-末端的R基团，最适合芳香

20、侧链和大的脂肪族侧链。酶的Tyr248（酪）、Arg145（精）、Glu270及Zn2+将底物分子适当地定位于活性中心中。第三十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（2）作用原理A、在底物诱导下，酶活性中心的结构发生巨大改变，底物的“靠近”和“定向”效应十分显著；B、酶的Glu270使底物的敏感肽键发生电子张力，使敏感肽键变得极易断裂。 C、底物结合的过程分五步酶侧链中Arg145上的正电荷与底物C-末端氨基酸残基上羧基的负电荷发生静电吸引作用；该氨基酸残基进入酶的非极性口袋中；底物敏感键上羰基中的氧与Zn2+离子相接近；肽键中氨基通过一个插入的水分子与酶中Glu270的侧链建立氢键。

21、 第三十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月D、构象变化结果Arg145的胍基和Glu270的羧基相向移动了0.2nm；Arg145的结合，使底物末端从口袋中推走了4个水分子，并将结合在Zn2+离子上的水分子推开（但留在附近） ，底物自身结合到Zn2+离子上；由于Arg145的移动带动了Tyr248的羟基移动1.2nm，从酶表面移到底物肽键附近，由此关闭了活性中心的凹道，活性中心从充满水的状态转变为疏水区。 第三十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月E、酶与底物结合后，Zn2+离子、Glu270和Tyr248的作用： Zn2+离子：使敏感肽键产生电子张力。酶与底物靠近时，敏感肽

22、键指向Zn2+离子，在该离子作用下，底物羰基碳原子的电子云密度降低，呈正电性，这样羰基碳原子在亲核攻击下更加脆弱。同时Glu270负电荷靠近肽键加大了这种偶极矩。因此Zn2+离子对底物造成的电子张力大大地促进了底物的水解。 Glu270和Tyr248：第一种说法：Glu270首先激活水分子，使其释放出OH-，由OH-直接攻击底物敏感肽键的羰基碳原子，同时Tyr248提供一个质子，由此底物的肽键直接水解；第二种说法：Glu270直接攻击羰基碳原子，并且Tyr248向该肽键的-NH-提供一个质子， 肽键断开，生成一个胺和一个Glu270与底物羰基相连的酸酐，最后水分子使酸酐水解，生成一个酸和复原的

23、酶。 注意：（1）Tyr248参与底物与酶的结合过程，而在催化过程中仅仅是起提供质子的作用，并不是催化所必需的；（2）在羧肽酶A中，底物有末端羧基，就能与Arg145的正离子基团形成盐键，触发Tyr248移至酶活性中心。如果底物没有末端羧基，就不发生这种结合和移动，酶则不表现活性。 第三十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 结论胰凝乳蛋白酶其活性中心由Ser195、His57及Asp102构成一个电荷转接系统，称为电荷中继网， 其催化反应包括水解反应的酰化阶段和水解反应的酰化阶段。胰蛋白酶、弹性蛋白酶都来源于胰脏，与胰凝乳蛋白酶的三维结构极为相似，一级结构氨基酸序列也有40%的相似性

24、，三者活性中心的丝氨酸残基附件的氨基酸序列完全一样，同属丝氨酸蛋白酶家族；他们的作用机理表现出极大的相似性，但底物的专一性有很大的差异。第四十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月1、酶的活性调节别构调节 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价结合后，引起酶的结构（构象）变化，进而改变酶的活性，这种调节称别构调节。受别构调节的酶称别构酶，引起别构调节的物质称为效应物/别构剂别构激活：因别构而导致酶活性增加正效应物别构抑制：因别构而导致酶活性降低负效应物四、酶的活性调节:别构调节、酶原激活、可逆共价修饰不同（效应调节物）：异促效应（heterotropic effect）相同（均为底物）

25、：同促效应（homotropic effect）效应物结合后对后继配体的影响效应物物性质正协同效应（positive cooperative effect）负协同效应（negative cooperative effect）第四十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（1）别构酶(Allosteric enzyme)的结构特征 别构酶一般是寡聚酶，常含多个亚基（有四级结构），通过次级键由多亚基构成。 除有结合底物和起催化作用的活性中心外，还含可结合调节物的别构中心，前者负责对底物的结合和催化，后者负责调节反应速度。别构酶的活性中心（活性部位）和别构中心（调节部位）位于酶蛋白的不同部位上，

26、可能在同一亚基上，也可能分别在不同的亚基上；每个别构酶分子可以有一个以上的活性部位和调节部位。第四十二张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（2）别构酶的动力学 别构酶不符合米氏方程，存在协同效应。所以其S对v的动力学曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或表观双曲线（负协同）。第四十三张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 S形曲线：表明酶结合一分子底物（或调节物）后，酶的构象发生变化，从而大大增加对后续底物分子的亲和性，促进后续分子与酶的结合，表现为正协同性，这种酶称为具正协同效应的别构酶。 表观双曲线：在底物浓度较低范围内酶的活力上升很快，但随后底物浓度虽有较大的提高，但反应速度

27、升高却很小，表现为负协同性，这种酶称为具有负协同效应的别构酶。第四十四张，PPT共五十九页，创作于2022年6月天冬氨酸氨基甲酰转移酶的别构调节（3）别构酶范例(天冬氨酸转氨甲酰酶,ATCase)第四十五张，PPT共五十九页，创作于2022年6月天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）以天冬氨酸与氨甲酰磷酸为底物催化，是嘧啶核苷酸合成多酶体系第一步。底物N-氨甲酰磷酸和天冬氨酸促进ATCase活性，为同促效应底物分子本身对别构酶的调节，能够对一个窄的范围内开始产物合成。但是能够被终产物CTP反馈抑制第四十六张，PPT共五十九页，创作于2022年6月CTP为最终产物，降低了酶与底物的亲和性，反馈抑制A

28、TCase活性；ATP为非底物分子，但可与CTP相互竞争调节部位增强酶与底物的亲和性而激活ATCase，起到了异促效应非底物分子的调节物对别构酶的调节作用。生物学意义：首先ATP信号激活，提供DNA复制的能量，导致CTP需求增大；CTP合成量满足生物体需要后，CTP反馈抑制其生物合成酶系的第一个酶，抑制反应。第四十七张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（4）别构模型 协同模型（对称模型，WMC模型） 别构酶由确定数目的亚基组成，每个亚基相对一种调节物只有一个结合位点，各亚基地位相等，因此每个别构酶都有一个对称轴； 每种亚基有两种构象，有利于结合底物或调节物的松弛型构象（R型）与不利于底物

29、或调节物结合的紧张型构象（T型）。这两种构象可采取同步协同方式互变（齐变方式），即各亚基在同一时间内均处于相同的构象状态，如果一个亚基从T态变为R态，则其他亚基也几乎同时转变成R态； 别构酶由一构象状态转变至另一构象状态时，其分子对称性保持不变。第四十八张，PPT共五十九页，创作于2022年6月第四十九张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 序变模型（KNF模型） 当调节物不存在时，别构酶只有一种构象存在（T），而不是处于 R=T的平衡状态，只有当调节物与之结合后才诱导T态向R态转变； 别构酶的构象是以序变方式进行的，而不是齐变。当调节物与一个亚基结合后，可引起该亚基构象发生变化，并使邻近

30、亚基易于发生同样的构象变化，即影响对下一个调节物的亲和力； 亚基间的相互作用可能是正协同效应，也可能是负协同效应，前者导致下一亚基对调节物有更大的亲和力，后者则降低亲和力。第五十张，PPT共五十九页，创作于2022年6月 酶蛋白肽链上的某些残基侧链在另一组酶的催化下发生可逆的共价修饰 ，使酶处于活性与非活性的互变状态，调节酶的活性。共价修饰主要有磷酸化、乙酰化、甲基化、腺苷化等。（1）磷酸化修饰 通过各种蛋白激酶的催化使酶蛋白中丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羟基发生磷酸化，又可通过各种蛋白磷酸酶催化水解此类磷酸基团，从而形成可逆的共价修饰来改变酶的构象，调节酶的活性。磷酸化及脱磷酸化分别由蛋白激酶及蛋白磷酸酶催化。可连锁进行，逐级磷酸化或脱磷酸化，出现级联放大。磷酸化以ATP供给磷酸基团，耗能远小于合成酶蛋白，作用快速具有P-O链接、P-N链接的磷酸化。2、酶的活性调节酶的共价修饰（covalent modification）第五十一张，PPT共五十九页，创作于2022年6月（2）蛋白激酶蛋白激酶是一大家族；根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基的种类可分为：Ser/Thr型、Tyr型；根据他们是否有调节物分：信使依赖型蛋白激酶、非信使