高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生

1、高山红景天叶肉原生质体分离培养与植株再生2022/9/81第1页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四目的：利用高山红景天组培苗叶片分离得到原生质体，经培养后获得再生植株。方法：研究外植体前期预处理、外植体的大小、酶液配比、酶液中甘露醇浓度等影响原生质体的相关因素，确定最优条件。2022/9/82第2页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四 高山红景天2022/9/83第3页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四高山红景天人工栽培利用的研究高山红景天2022/9/84第4页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四高山红景天：

2、为景天科红景天属多年生草本植物，是长白山珍稀药用植物之一，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能。2022/9/85第5页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四 一 材料和方法 1.材料 高山红景天组 培苗叶片2022/9/86第6页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四2. 原生质体分离：取材：幼嫩叶片(长 0.53 ）切成宽1.02.0 mm 的条状酶液配制：0.5 %2 %纤维素酶 + 0.3 %1 %果胶酶 + 10 mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 %MES + 0.7 mmol/ L KH2 PO4 + 0.40.6mo

3、l/ L 甘露醇, p H = 5.8酶解处理：以1 10 的量将材料放入酶液。于25 ,黑暗条件下振荡酶解15h ,转速为80 r/ min 。2022/9/87第7页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四3.原生质体纯化：酶解后的原生质体和酶混合液经250 目的尼龙网滤过后以800 r/ min 离心8min 沉降原生质体。向沉降的原生质体中再加入洗涤液和液体培养基各清洗1 次备用。洗涤液：10mmol/ L CaCl2 2H2O + 0.1 % MES + 0.7mmol/ LKH2 PO4 + 0.4 mol/ L 甘露醇, p H = 5.8液体培养基：1/ 2MS

4、 + 1 mg/ L 2 ,42D + 0.5 mg/ L ZT + 0.5 mol/ L 甘露醇 + 5 00 mg/ L 水解酪蛋白。2022/9/88第8页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四4. 原生质体存活率及产量的测定：活力测定:采用EvansBlue 染色法，存活率= (未染蓝细胞数/ 细胞总数) 100 %。 原生质体产量:用血球计数板进行计数,以每克鲜质量组织获得的原生质体个数(个/ g) 来表示.2022/9/89第9页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四5. 原生质体培养：将原生质体密度调到210 105 个/ mL , 转入原生质

5、体液体培养基中进行液体浅层黑暗静置培养。在培养过程中每10 d 以3 1(原生质体培养基无渗透压调节剂培养基) 比例加入无渗透压调节剂培养基,逐步降低渗透压。2022/9/810第10页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四6.愈伤培养与植株再生: 当多细胞团进一步增大,形成肉眼可见的小愈伤组织时,挑出并转移到愈伤组织培养基MS + 6-BA 2 mg/ L + NAA 0.5 mg/L ,转为光照培养之前,首先经过23 d 的弱光培养锻炼阶段,然后转入光照培养,继续培养约1 个月时间。 经3 次继代培养后,挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基MS + 1 mg/ L 6-BA

6、 + 0.1 mg/ L NAA ,待小芽长至2.0 cm 左右,切下转入生根培养基上形成完整植株,生根培养基为1/ 2MS。培养基p H = 5.8-6.0 ,琼脂6 g/ L ,蔗糖25 g/ L ,在1.2 kg/ cm2压力下灭菌20 min ,培养温度(25 2) ,光照强度为2 0003 000 lx ,每天光照12 h 。2022/9/811第11页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四 二、结果与分析影响天原生质体分离的因素光叶片大小酶类组合2022/9/812第12页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四1.光照与黑暗2022/9/813第

7、13页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四结果表明：在相同酶解条件下，光照与黑暗处理对高山红景天原生质体产量间差异不显著，因此，在进行原生质体分离以前，对组培苗是否光照不是影响原生质体产量的关键因素。在此实验中，直接采取没有进行黑暗预培养的组培苗进行原生质体分离。2022/9/814第14页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四2.叶片大小2022/9/815第15页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四在相同酶解条件下，长度大于1.5cm的叶片原生质体产量显著高于长度小于1.5cm的处理，因此，选用长度大于1.5cm的叶片为宜。2022

8、/9/816第16页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四3.酶类组合 纤维素酶与果胶酶组合2022/9/817第17页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四 各处理存活率大小顺序为:1 4 5 2 7 3 8 6 9 各处理产量大小顺序为: 5 3 6 2 7 4 8 1 9综合来看，处理5的产量显著高于其他处理，因此，采用处理5 的酶液组合（1%纤维素酶 + 0.5%果胶酶）可获得最大存活原生质体产量。2022/9/818第18页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四4.酶解时间与酶液中甘露醇浓度对高山红景天原生质体产量的影响：2022

9、/9/819第19页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四时间影响：14 h随酶解时间的延长，原生质体产量递增，在4 h时达到最高值，以后随时间的延长，产量下降。酶解后期的产量和存活率下降，是由于酶解液长时间浸泡造成部分原生质体破裂和损伤引起的。2022/9/820第20页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四酶液中甘露醇对原生质体产量和存活率的影响： 酶液中采用0.5 mol/L 甘露醇的处理经纯化后呈圆球型，可观察到大量叶绿体的存在。因此，酶液采用0.5 mol/L 的甘露醇用于维持原生质体渗透压效果较好。2022/9/821第21页，共24页，2022年，5月20日，20点22分，星期四高山红景天原生质体培养与植株再生：将纯化的原生质体密度调到2105个/mL,在黑暗条件下进行液体浅层培养，经3天可见第一次细胞分裂，约40d时，可形成肉眼可见的愈伤组织。经过23d 的弱光培养，将愈伤组织转移到培养基MS+2mg/L NAA上精心光照培养。继续培养约45d时，愈伤组织生长旺盛，并有少量芽体萌发，挑选鲜绿色愈伤组织转入芽分化培养基MS+1mg/L6-BA NAA进行芽诱导，待芽长到2.0cm 左右，切下转入1/2生根培养基上形成完整植株。20