吸光光度法 (3)讲稿

1、关于吸光光度法 (3)第一张，PPT共九十页，创作于2022年6月1化学分析：常量组分(1%), Er 0.1%0.2% 依据化学反应, 使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较仪器分析：微量组分(vr 第八张，PPT共九十页，创作于2022年6月8能级跃迁紫外-可见光谱属于电子跃迁光谱。电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。第九张，PPT共九十页，创作于2022年6月9吸收光谱 Absorption Spectrum纯 电子能态 间跃迁S2S1S0S3hE2E0E1E3S2S1S0hAhhh分子内电子跃迁带

2、状光谱锐线光谱A第十张，PPT共九十页，创作于2022年6月10（1）转动能级间的能量差Er：0.0050.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；（2）振动能级的能量差Ev约为：0.05eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；（3）电子能级的能量差Ee较大120eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光谱或分子的电子光谱讨论：第十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月11 （4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。 （5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有

3、关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数max也作为定性的依据。不同物质的max有时可能相同，但max不一定相同； （6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。第十二张，PPT共九十页，创作于2022年6月12 物质对光的选择性吸收及吸收曲线M + h M *M + 热M + 荧光或磷光基态 激发态E1 （E） E2 E = E2 - E1 = h 量子化 ；选择性吸收; 分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同； 用不同波长的单色光照射，测吸光度 吸收曲线与最大吸收波长 max； 光的互补：蓝 黄第十三张，PPT共九十页，创作于2022年

4、6月13 若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿第十四张，PPT共九十页，创作于2022年6月14/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光第十五张，PPT共九十页，创作于2022年6月15吸收曲线的讨论： （1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max （2）不同浓度的同一种物质，

5、其吸收曲线形状相似max不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。 （3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。 （4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在max处吸光度A 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。 （5）在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。定性、定量基础第十六张，PPT共九十页，创作于2022年6月16定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。AC增大第十七张，PPT

6、共九十页，创作于2022年6月1710.1.2 光吸收的基本定律 1.朗伯比耳定律 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。Ab 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A c 二者的结合称为朗伯比耳定律，其数学表达式为： 第十八张，PPT共九十页，创作于2022年6月18朗伯比耳定律数学表达式 Alg（I0/It)= b c 式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位molL； ：摩尔吸光系数，单位Lmolcm；

7、 或: Alg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位gL a：吸光系数，单位Lgcm a与的关系为： a =/M （M为摩尔质量） 第十九张，PPT共九十页，创作于2022年6月19吸光度与光程的关系 A = bc 光源检测器0.00吸光度检测器b样品光源0.22吸光度光源检测器0.44吸光度b样品b样品第二十张，PPT共九十页，创作于2022年6月20吸光度与浓度的关系 A = bc 吸光度0.00光源检测器 吸光度0.22光源检测器b 吸光度0.42光源检测器b第二十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月21透光度(透光率)T透光度T : 描述入射光透过溶液的程度: T =

8、 I t / I0吸光度A与透光度T的关系: A lg T 朗伯比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量； 摩尔吸光系数在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度； 吸光系数a(Lg-1cm-1）相当于浓度为1 g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。第二十二张，PPT共九十页，创作于2022年6月222.摩尔吸光系数的讨论 （1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数； （2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关； （3）可作为定性鉴定的

9、参数； （4）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以max表示。max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。 第二十三张，PPT共九十页，创作于2022年6月23 （5）max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。105：超高灵敏； =(610）104 ：高灵敏； 2104 ：不灵敏。 （6）在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。摩尔吸光系数的讨论第二十四张，PPT共九十页，创作于2022年6月243.偏离朗伯比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶

10、液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。第二十五张，PPT共九十页，创作于2022年6月25（1）物理性因素 难以获得真正的纯单色光。 朗比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。 第二十六张，PPT共九十页，创作于2022年6月26非单色光作为入射光引起的偏离 假设由

11、波长为1和2的两单色光组成的入射光通过浓度为c的溶液，则： A 1lg（o1 /t1 ）1bc A 2lg(o2 /t2 ）2bc故：式中：o1、o2分别为1、2 的入射光强度； t1、t2分别为1、2 的透射光强度； 1、2分别为1、2的摩尔吸光系数；因实际上只能测总吸光度A总，并不能分别测得A1和A2，故第二十七张，PPT共九十页，创作于2022年6月27 因实际上只能测总吸光度A总，并不能分别测得A1和A2，故： A总 lg（o总/t总 ) lg(Io1+o2)/(t1+t2） lg(Io1+o2)/(o110-1bc +o210-2bc ）令： 1-2 ；设： o1 o2 A总 lg(

12、2Io1)/t1(110 - bc ） A 1 + lg2 - lg(110 - bc ) 讨论:第二十八张，PPT共九十页，创作于2022年6月28讨论: A总 =A1 + lg2 - lg(110bc ) (1) = 0； 即： 1= 2 = 则： A总 lg（o/t） bc(2) 0 若 0 ；即 20, lg(110 bc )值随c值增大而增大，则标准曲线偏离直线向c 轴弯曲，即负偏离；反之，则向A 轴弯曲，即正偏离。第二十九张，PPT共九十页，创作于2022年6月29讨论: A总 =A1 + lg2 - lg(110bc ) (3) 很小时，即12： 可近似认为是单色光。在低浓度范围

13、内，不发生偏离。若浓度较高，即使 很小， A总 1 ，且随着c值增大， A总 与A 1的差异愈大，在图上则表现为Ac曲线上部(高浓度区)弯曲愈严重。故朗伯比耳定律只适用于稀溶液。 (4) 为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。第三十张，PPT共九十页，创作于2022年6月30(2) 化学性因素 朗比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、

14、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。第三十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月31偏离朗伯-比尔定律的原因非单色光引起的偏离 2. 介质不均匀引起的偏离3. 由于溶液本身的化学反应引起的偏离 解离、络合反应、其他反应4. 显色反应的干扰第三十二张，PPT共九十页，创作于2022年6月32朗伯-比尔定律的适用条件单色光 应选用max处或肩峰处测定2. 吸光质点形式不变 离

15、解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)3. 稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强第三十三张，PPT共九十页，创作于2022年6月33吸光度的加和性与吸光度的测量 A = A1 + A2 + +An 用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。第三十四张，PPT共九十页，创作于2022年6月3410.2 紫外可见分光光度计第三十五张，PPT共九十页，创作于2022年6月35第三十六张，PPT共九十页，创作于2022年6月3610.2.1基本组成光源单色器样品室检测器显示1. 光源 在整个紫外光区或可见光谱

16、区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3202500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185400 nm的连续光谱。第三十七张，PPT共九十页，创作于2022年6月37 2.单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； 聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝。第三十八张，PPT共九十页，创作于2022年6月38棱镜：依据不同波长光通

17、过棱镜时折射率不同单色器入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫12800 600 500400第三十九张，PPT共九十页，创作于2022年6月39光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.第四十张，PPT共九十页，创作于2022年6月403. 样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，

18、常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5. 结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理第四十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月41光电管红敏管 625-1000 nm蓝敏管 200-625 nmNi环（片）碱金属光敏阴极h第四十二张，PPT共九十页，创作于2022年6月42光电倍增管待扫描160-700 nm1个光电子可产生106107个电子第四十三张，PPT共九十页，创作于2022年6月4310.2.2分光光度计的类型1.单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。2.双光束 自动记录，快速

19、全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。第四十四张，PPT共九十页，创作于2022年6月443.双波长 将不同波长的两束单色光(1、2) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。第四十五张，PPT共九十页，创作于2022年6月45多通道仪器（Multichannel Instruments） 光电二极管阵列(通常具有316个硅二极管) photodiode arrays (PDAs) 同时测量200820nm范围内的整个光谱, 比单个检测器快316倍,信噪比增加 31

20、6 1/2 倍. 其他类型分光光度计将光度计放入样品中, 原位测量. 对环境和过程监测非常重要.纤维光度计第四十六张，PPT共九十页，创作于2022年6月46镀铝反射镜纤维光度计示意图第四十七张，PPT共九十页，创作于2022年6月47纤维光度计第四十八张，PPT共九十页，创作于2022年6月4810.3 显色反应及其影响因素10.3.1显色反应和显色剂1.选择显色反应时，应考虑的因素 灵敏度高，选择性好； 有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式； 生成物稳定； 显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之差要求 60nm,对照性好。 第四十九张，PPT共九十页，创作于2022年6月

21、49：助色团NH2，OH，X （孤对电子）neO生色团：NN，NO，OC=S,N （共轭双键）e无机显色剂: SCN- Fe(SCN)2+ H2O2 TiOH2O22+有机显色剂:2.显色剂第五十张，PPT共九十页，创作于2022年6月50有机显色剂CH3CCCH3 HON NOH NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸第五十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月5110.3.2 影响显色反应的因素1.显色剂用量 吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。2.溶液的酸度3.

22、显色反应时间4.显色反应温度5.溶剂 一般尽量采用水相测定6.干扰离子的影响第五十二张，PPT共九十页，创作于2022年6月52c(R)c(R)c(R) 显色剂用量（c(M)、pH一定）Mo(SCN)32+ 浅红Mo(SCN)5 橙红Mo(SCN)6- 浅红Fe(SCN)n3-n第五十三张，PPT共九十页，创作于2022年6月53 显色反应酸度（c(M)、 c(R)一定）pH1pH2.控制适宜的吸光度（读数范围）第五十九张，PPT共九十页，创作于2022年6月59控制适宜的吸光度（读数范围） 不同的透光度读数，产生的误差大小不同： A=lgT=bc微分：dA=dlgT0.434dlnT = -

23、 0.434T -1 dT =b dc两式相除得： dA/A= （ 0.434 / TlgT ）dT =dc/c 以有限值表示可得： A/A = c/c =（0.434/TlgT）T 浓度测量值的相对误差（c/c）不仅与仪器的透光度误差T 有关，而且与其透光度读数T 的值也有关。 是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？ 第六十张，PPT共九十页，创作于2022年6月60最佳读数范围与最佳值 设：T =1%，则可绘出溶液浓度相对误差c/c与其透光度T 的关系曲线。如图所示： 当：T =1%，T 在15%65%之间时，浓度相对误差较小，最佳读数范围。 用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T %=15

24、65% (吸光度 A =0.800.20)。 可求出浓度相对误差最小时的透光度Tmin为： Tmin36.8%, Amin0.434第六十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月6110.5 吸光光度法10.5.1 普通吸光光度法1.单组分的测定 目视比色法 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。2.多组分的同时测定 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。 若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 第六十二张，PPT共九十页，创作

25、于2022年6月62目视比色法未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）不可分辨多组分方法简便，灵敏度高标准系列第六十三张，PPT共九十页，创作于2022年6月 光电比色法通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)光电比色计结构示意图灵敏度和准确度较差第六十四张，PPT共九十页，创作于2022年6月6410.5.2、示差吸光光度法（示差法） 普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs cx)。则： Ax= b cx

26、As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差。 示差法测得的吸光度与c呈直线关系,由标准曲线上查得相应的c值，则待测溶液浓度cx ：cx = cs + c 第六十五张，PPT共九十页，创作于2022年6月65示差法标尺扩展原理： 普通法： cs的T=10%；cx的T=5% 示差法： cs 做参比，调T=100% 则： cx的T=50% ；标尺扩展10倍第六十六张，PPT共九十页，创作于2022年6月66例题已知 dT = 0.01, 样品Tx = 2.00 %, 标准 Ts = 10.0 %示差法常规法误差示差法误差已知 dT

27、 = 0.01, 样品Tx = 2.00 %, 标准 Ts = 5.00 %第六十七张，PPT共九十页，创作于2022年6月6710.5.3、双波长分光光度法 不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(1和2)；以参比波长1处的吸光度A1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。 A A2 A1 (2 1)b c 两波长处测得的吸光度差值A与待测组分浓度成正比。1和2分别表示待测组分在1和2处的摩尔吸光系数。第六十八张，PPT共九十页，创作于2022年6月68关键问题: 测量波长2和参比波长1的

28、选择与组合 以两组分x和y的双波长法测定为例：设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为: Ax和Ay，则该体系的总吸光度差Ax+y为： Ax+y = A x + A y 如何选择波长1 、2有一定的要求。第六十九张，PPT共九十页，创作于2022年6月69选择波长组合1 、2的基本要求是： 选定的波长1和2处干扰组分应具有相同吸光度，即： Ay = A y2 A y1 = 0故： Ax+y = A x=(x2x1)bcx此时：测得的吸光度差A只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。 在选定的两个波长1和2处待测组分的吸光度应

29、具有足够大的差值。 可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。第七十张，PPT共九十页，创作于2022年6月7010.5.4、导数光度分析法 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析： 0 e-bc假定入射光强度0 在整个波长范围内保持恒定： dI 0 /d0则：dI/d0 bc e -bc d/d bc d/d 第七十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月71 dI/d bc d/d 一阶导数信号与试样浓度呈线性关系； 测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长

30、的变化率d/d。吸收曲线的拐点处d/d最大，故其灵敏度最高(见图）。 同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略） 第七十二张，PPT共九十页，创作于2022年6月7210.6 吸光光度分析法的应用1. 单一组分测定1) 金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟, Co-钴试剂2) 磷的测定: DNA中含P9.2%, RNA中含P9.5%, 可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(小)磷钼(V)蓝(大)Sn2+第七十三张，PPT共九十页，创作于2022年6月733) 蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)

31、氨基酸测定茚三酮(紫色化合物)5) 水质检测: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6) 药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测定.7) 紫外吸收(UV): NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。第七十四张，PPT共九十页，创作于2022年6月742. 多组分的测定 xl1, eyl1, exl2, eyl2由x,y标液 在1, 2处分别测得在1处测组分x, 在2处测组分yb) 在1处测组分x; 在2处测总吸收,扣除x吸收,可求yc) x,y组分不能直接测定A1=exl1bcx+ eyl1bcy(在1处

32、测得A1) A2 =exl2bcx+ eyl2bcy(在2处测得A2)第七十五张，PPT共九十页，创作于2022年6月75 3. 光度滴定NaOH滴定 对硝基酚 pKa=7.15 间硝基酚 pKa=8.39 pKa =1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚间硝基酚酸形均无色.碱形均黄色第七十六张，PPT共九十页，创作于2022年6月76典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。Vsp滴定剂吸收Vsp被滴物吸收Vsp滴定剂与待测物均吸收Vsp产物吸收第七十七张，PPT共九十页，创作于2022年6月774. 络合物组成的测定(1)摩尔比法: 固定cM ,改变cR

33、 1:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 第七十八张，PPT共九十页，创作于2022年6月78(2)等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:2第七十九张，PPT共九十页，创作于2022年6月79表观形成常数的测定 (设M、R均无吸收)0.5cM/cM:R=1:1A0Ac(M)=c(R)=cMmRn型 ?第八十张，PPT共九十页，创作于2022年6月805.一元弱酸离解常数的测定 HL HLKaH+L/HL高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以L存在，可测得AL Lc(HL).代入整理：HLL或配制一系列c相同,pH不同的溶液,测A.第八十一张，PPT共九十页，创作于2022年6月81MO吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa35040045050