实时荧光定量pcr实验报告

1、文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.实时荧光定量pcr实验报告篇一：实时荧光定量PCR方法简介实时荧光定量PCR方法简介实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n （n代表PCR循环的次数） 指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中， 随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合 酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线 性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光 信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起 始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、E

2、B染色后也 完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始 拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数Ct值，定量的 根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性 反比关系。Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信 号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结 束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。Ct值的定义Ct值中的“ C”代表Cycle （循环），t”代表检测 threshhold （阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强 度达到阈值所需要的循环数；也可以理解

3、为扩增曲线与阈值 线交点所对应的横坐标。Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关 系（y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指 数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此 利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。 传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台 期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接 的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、 相同的反

4、应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct 值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300 个单位。此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防 止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的 扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统 方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造 成二次污染的可能性。荧光定量PCR的2类方法（按荧光产生的原理分 类）染料法（SYBR Green法）染料法即利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行 样品定量。该方法与常规的PCR类似，唯一的区别是在反应

5、 体系中加入了 SYBR Green染料分子。该染料分子的激发波 长为497nm，发射波长为520nm。与EB的性能类似，SYBR Green 也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本 底，当反应体系中存在dsDNA时，SYBR Green能特异性的 与之结合并在497nm激发下。染料法的优点：1，无需设计、合成探针，实验成本低； 2，使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。染料法的缺点：1，由于SYBR Green与dsDNA的结合只 具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序 列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二 聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩

6、增效率的降低、 结果的不准确。因此采用该方法对于引物的设计及实验条件 的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增; 2，由于SYBR Green的上述特点，该方法不能应用于 Multiplex QPCR技术。（在一个反应管中同时检测多个目的 基因的表达情况）探针法（以TaqMan探针为例）探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于:在上、 下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有 荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与 待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。目前 市场上的探针主要种类有：TaqMan、Molecular Beacon、 Scor

7、pions、Hybirdization 等，其中以 TaqMan 探针应用最 广泛。TaqMan探针的结构：长度与普通PCR引物类似，大约 20bp左右。在5与3端各标记有一个荧光基团，5的荧 光基团称为报告基团（Report），3的荧光基团称为淬灭基 团（Quencher）。TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情况下用特定的 波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很 近，因此报告基团能够通过FRET （Fluorescence Resonance Energy Transfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者 以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特定波长的荧

8、光信号。TaqMan探针法工作原理：?变性（95 C）：模板dsDNA充分解链；?复性、延伸、酶切降解（60 C）： 1,探针与靶序列 结合；上、下游引物与靶序列结合；3,上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（5 3聚合功能）；4,当上游引物延伸到TaqMan探针的5端 时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥5一3外切功能将探 针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成；?荧光信号的检测：由于TaqMan探针被水解，报告基 团在受到激发后不能再通过FRET作用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告 基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。与染料法相比TaqMan探针法的

9、优点：1，实验的特异性 得到了提高；2,对探针的5端采用不同的荧光标记就可以 进行 Multiplex QPCR。与染料法相比TaqMan探针法的缺点：1，探针的使用提高了实验成本；2，探针 的使用需要设计及优化。确定样品起始模板拷贝数的2类方法绝对定量采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数 的样品）建立标准曲线，建立Ct值与样品起始模板拷贝数 的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出 起始模板量。标准品的种类：含目的基因的质粒（经酶切线性化处理， 其中的插入片段必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得 到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同 的引物扩

10、增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等， 前2种标准品使用较为广泛。标准品的定量：UV A260、荧 光分光光度检测等。为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进 行归一化的处理：1，对各样品进行细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强， 尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2,对纯化后得到的总RNA 进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。相 对定量与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因 表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的 细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基 因的差异化表达。就研究目的而论，该方法比绝对

11、定量的应 用范围更广泛、更符合研究的目的。某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下：公式说明：Rel.Quantity:目的基因在样品与对照品间表达差异的 倍数；GOI ：目的基因(Gene of Interest)；Norm:内参基因(Reference Gene，Normalizer，House Keeping Gene)Eff： PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分 母部分为内参基因的扩增效率；使用该公式时，需要通过 实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公 式进行计算；如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于 100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率

12、默认为100%，这 样公式就简化为2- 。?为什么需要设立内参基因？如果仅仅比较目的基因的 Ct是不能准确反映样品间 目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响：1， 样品处理时不同的纯化得率；2, RT-PCR过程中不同的逆转 录效率；3, QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。由于上述 3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上，因此需要引 入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理，使得所有样品 目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，这样得 出的结果才具有可信性与良好的重复性。（注意：内参基因 的（1+EffCt）位于分母的位置，进行除法的运算。）?如何选择内参基因？符合什么标

13、准的基因可以作为 内参基因？由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必须满 足以下3个条件：1,在不同的细胞、组织中具有恒定的表 达；2,在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；3, 在不同的实验状态下具有恒定的表达。内参基因的ACt一般 小于2（即小于1倍的表达差异），一般采用的内参基因都是 一些管家基因，使用最多的为：？-actin、GAPDH、18sRNA等。需要注意的是：并非传统意义上的管家基因都能作为内 参基因，还是需要与具体的实验结合起来综合考虑。例如 GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达，不能作为内参 基因。因此在选择内参基因时建议：1，查阅相关文献；2, 设立多个

14、内参基因；3,采用表达谱的方法确定理想的内参 基因。?采用 Singleplex 还是 Multiplex?篇二：实时荧光定量PCR具体实验步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入 0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15 到30C孵育2到3分钟。4C下IXXrpm离心15分钟。离心 后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水 相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是 匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶

15、的离心管 中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到 30C孵育10分钟后，于4C下1XXrpm离心10分钟。此时 离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀 块。RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品 中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清 洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室 温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40 rl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保 存于-80C待用。2 RNA质量检测

16、1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm 和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。浓度测定A260下读值为1表示40 gRNA/mlo样品RNA浓度3 g/ml）计算公式为：A260 X稀释倍数X 40 rg/ml。具体计 算如下：RNA溶于40 nl DEPC水中，取5ul, 1:100稀释至495 1 的 TE 中，测得 A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 X100 X40 ng/ml = 840 ng/ml 或 0.84 rg/H取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35

17、 rl，剩余 RNA总量为：35 rl X 0.84 rg/rl = 29.4 rg纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8 到 2.1o2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C，10 ml的10XMOPS电泳缓冲液和18 ml的37%甲醛溶液（12.3 M）。10XMOPS电泳缓冲液浓度成分0.4M MOPS, pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 nl溶液。 胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1 XMOPS电泳缓冲液至覆盖胶 面几个毫米。准备RNA样品取3 gRNA

18、,加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛 上样染液中至终浓度为10g/mlo加热至70C孵育15分钟 使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5 - 6V/cm电压下2h，电泳至漠酚兰指示剂进胶至少2 - 3cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于 用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面 一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它 由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和 28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是 由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中

19、如果出现DNA 污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量 的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的 弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反应体系序号反应物剂量1 逆转录 buffer 212上游引物0.213下游引物0.21dNTP 0.1H逆转录酶MMLV 0.51DEPC 水 5HRNA模版2 H8总体积 10 H轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70C干浴3分钟， 取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 1，37 C水浴60分钟。取出后立即95C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为 cD

20、NA溶液，保存于-80C待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（B -actin） 实时定量PCRB-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度 为1011,反应前取31按10倍稀释（加水27 nl并充分混 匀）为1010，依次稀释至 109、108、107、106、105、104, 以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料 10 口 12阳性模板上游引物F 0.513阳性模板下游引物R 0.51dNTP 0.51Taq 酶 1H6阳性模板DNA 5H7 ddH2O 32.518总体积50 H轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基

21、因反应体系：序号 反应物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 口 12内参照上游引物F 0.513内参照下游引物R 0.51dNTP 0.51Taq 酶 1H6待测样品cDNA 5H7 ddH2O 32.518总体积50 H轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件 为：93C 2分钟，然后93C 1分钟，55C 2分钟，共40 个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的 cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量10X PCR 缓冲液 2.5 ulMgC12 溶液 1.5

22、 ul3上游引物F 0.5 u14下游引物R 0.5 u15 dNTP混合液3 u1Taq聚合酶 1 ulcDNA 1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94C1分钟；55C1分钟；72C1分钟）； 72oC延伸5分钟。PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖 凝胶电泳，漠化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性 扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进行10 倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1X 1010，依次稀释至109、 108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待 测基因实时定量PCR所

23、有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物1ul3下游引物1uldNTP1ulTaq聚合酶2ul6待测样品cDNA 5ul7 ddH2O30ul 8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进 行PCR扩增反应。反应条件为：93C2分钟预变性，然后按 93C 1分钟，55C 1分钟，72C1分钟，共40做个循环，最 后72C7分钟延伸。7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则： 引

24、物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定 的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配）。8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR 反应。PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳， GoldView?染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 篇三：生物实验4实时定量PCR实验报告实验四定量PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999同组 人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号累积实时监测整PCR进

25、程，最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷 贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料real time PCR 仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量 移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品四、实验步骤1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107， 106, 105, 104，向每管加入90 H ddH2O,取10H 108 copy/ul的标样加 入到107管中，充分

26、混匀后，从管中取10l 107 copy/ul的液体到106管中。按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。注意，每次稀释都要换Tip头。2、配制预混液：取1191 ddH2O、7H引物4204f、7H1 引物 4448r 和 71 Rox到装有175 H SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、 105、 104、 UNK（未知样）、NTC （阴性对照）。向其中分别加入42H 预混液和4.7 口 1模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。分别取 上述样品

27、20 口 1至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。 将加好样的8联管振荡。5、设置分析仪参数如下：95C 3min； 95C 15s+60C 40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围6095C。振荡好的样品进机 进行PCR扩增。6、扩增后利用软件分析值及未知样的定量结果。五、实验结果与讨论1、实验结果如何？试分析。答：实验结果及分析如下。（1）、实验具体数据见下表QuantityWell Task C t C t Mean C t SD Quantity MeanQuantity SD Ct Threshold A1 STANDARD 8.2488 8.2527

28、0.00550A2STANDARD 8.2565 8.2527 0.0055 0B1STANDARD 11.3893 11.6598 0.3825B2STANDARD 11.9303 11.6598 0.3825C1STANDARD 15.3292 14.9668 0.5126 1000000C2STANDARD 14.6043 14.9668 0.5126 1000000D1STANDARD 19.4912 19.3080 0.2590 100000D2STANDARD 19.1249 19.3080 0.2590 100000E1STANDARD 22.5385 22.4196 0.1681 10000E2STANDARD 22.3007 22.4196 0.1681 10000F1UNKNOWN 8.9370 8.9691 0.04541695285.625F2UNKNOWN 9.0012 8.9691 0.04541695285.625G1NTC 32.5329G2NTC 32.9549其中，A-E为标准样品，F为位置样品，G为阴性对照。每个样品做两个平行。通过软