趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

1、趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定【关键词】因子lning,expressin,purifiatinandidentifiatinfR5extraellulardainrebinantprtEin【Abstrat】AI:TnstrutaprkarytiexpressinvetrfR5extraellulardainrebinantprteinandtpurifyandidentifyit.ETHDS:TbtainainaidsequenefR5extraellulardains,thefurpeptidesfR5Nter,EL1,EL2andEL3erebinedusi

2、ngthesftlinkerandnaedrR5.RR5geneassynthesizedardingtdnE.lipreferred.ThegeneaslnedintthevetrpET22b+andtheaiprteinasexpressedinE.li.Theexpressinprdutaspurifiedandthenidentifiedithesternblt.RESULTS:edevelpedapurifiatinpressfrR5frinlusinbdies.Thepredureinludedashingandslubilizatinfinlusinbdy,purifiatinb

3、ySepharylS300andrefldingbySepharylS100.TheresultfesternbltshedthespeifibindingfR5Abithaiprtein.NLUSIN:PurifiedrebinantprteinrR5isbtainedsuessfully,hihanbeusedasaandidateantigenfrR5autvainethallengeHIV1infetin.【Keyrds】R5;PADRE;inlusinbdies;reflding;autvaine;HIV1infetin【摘要】目的：构建趋化因子受体5(R5)胞外段重组蛋白(命名为：

4、rR5)原核表达载体，并进展诱导表达.对表达产物进展纯化和鉴定.方法：截取R5胞外构造4个片段NTer，EL1,EL2和EL3的氨基酸序列，应用柔性linker分别串联，模拟R5胞外构造，根据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进展表达,表达产物经纯化、复性后进展esternblt鉴定.结果：目的蛋白以包涵体形式存在，经包涵体洗涤、变性溶解，SepharylS300凝胶过滤层析及SepharylS100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质，目的蛋白能与R5Ab特异性结合.结论：获得了大量纯化的rR5重组蛋白，可作为研制R5自体蛋白疫苗以阻断HIV1感染的候选抗原蛋白.【关键词】

5、R5;人工手动HTL表位；包涵体;复性;自体疫苗;HIV1感染0引言趋化因子受体5(R5)是HIV1感染初期病毒进入体内最重要的辅助受体1，近几年来，以R5为靶点的抗HIV1策略倍受关注，通过小分子拮抗剂、单克隆抗体及基因干预等不同手段减弱或降低细胞外表R5的功能到达对抗HIV1感染的目的2-5.其中以R5为靶向的自体疫苗开拓了艾滋病疫苗研究的新途径6.R5自体疫苗通过诱导机体自身产生针对自身分子R5的抗体进而与细胞外表的R5结合，降低细胞外表的R5的数量，减少了HIV1病毒感染的时机，到达预防HIV1感染的效果.我们构建人R5胞外段重组蛋白表达载体，对获得的重组蛋白纯化、复性.为构建R5自体

6、蛋白疫苗提供实验根据.1材料和方法1.1材料各种限制性内切酶、T4DNA连接酶TaKaRa公司；DL2000DNAarker大连宝生物工程公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒上海博亚生物技术；蛋白arker羊抗鼠二抗华美公司；小鼠抗人R5AbRD公司.其他试剂均为国产分析纯.原核表达载体pET22b(+)质粒为本室保存.宿主菌为大肠杆菌BL21.5L发酵罐B.Braun公司.4高速离心机、冻干机Bekan公司.凝胶柱填料SepharylS300，SepharylS100及纯化设备AershaPharaiaBiteh公司.1.2方法1.2.1R5胞外段基因的合成分析SissPr蛋白质数据库R5的构

7、造，截取R5胞外4个片段NTer,EL1,EL2,EL3的氨基酸序列，分别为NTer:DYQVSSPIYDINYYTSEPQKINVKQIAAR(31)；EL1：YAAAQDFGNTQ(14)；EL2:RSQKEGLHYTSSHFPYSQYQFKNFQTLK(30)；EL3:NTFQEFFGLNNSSSNRLDQA(22).应用柔性linker氨基酸序列为GGGGS分别串联，获得模拟R5胞外片段的氨基酸序列(命名为：rR5)，按照已公布的人R5的基因序列，于5端插入Nde酶切位点,3端引进终止密码子TGA并插入Sal酶切位点，根据大肠杆菌偏爱的密码子，送交上海生工生物技术公司合成目的基因.1.

8、2.2pET22b(+)/rR5表达载体的构建将含有合成目的基因的质粒pU57经Nde和Sal双酶切后，回收360bp左右的小片段，同时用Nde和Sal双酶切pET22b(+)，回收大片段.建立连接体系，16连接过夜.连接产物转化感受态DH5细胞，提取质粒，经酶切鉴定和DNA测序正确后获得含有rR5基因原核表达载体，命名为pET22b(+)/rR5.1.2.3pET22b(+)/rR5原核载体的表达pET22b(+)/rR5转化感受态BL21细胞，挑取含重组表达质粒的大肠杆菌BL21单菌落并接种于5L含100g/L氨苄青霉素Ap的新颖LB培养液中,37摇床培养过夜,次日以1100接种于含100

9、g/LAp的新颖LB培养液中,37继续培养至细菌密度到达A600n=0.40.6,1l/LIPTG诱导，4h后收菌，小规模培养及诱导后离心搜集菌体,SDSPAGE检测目的蛋白的表达和存在形式.1.2.4工程菌的发酵从活化的LB平板上挑选单菌落接种于含LB的试管中,37培养10h,转种至含200LLB的三角瓶中,37培养过夜.次日将种子液接种于5L发酵罐.控制发酵温度37，转速250450r/in、通气量35L/in，pH7.3.培养至A600n=8时,1l/LIPTG诱导，继续培养4h,终止发酵,搜集菌体、称质量，-20冰箱保存备用.取少量菌体处理后用SDSPAGE检测目的蛋白的表达.1.2.

10、5目的蛋白包涵体的别离和洗涤取10g发酵菌体,按1g湿菌质量对7L的比例,用裂解缓冲液STE(50l/LTrisHl,pH8.0,50l/LNal,1l/LEDTA)重悬,-20过夜.次日于室温水浴中融化,溶菌酶法裂菌，400超声破菌，其中超声5s,间隔10s,共进展100次.12000g4离心20in,弃上清,沉淀用包涵体洗涤液A(10L/LTritnX100,1l/LEDTA,10g/LD，50l/LTrisHl，pH8.5,100l/LNal)重悬,12000g4离心20in,弃上清.再用包涵体洗涤液B50l/LTrisHl，pH8.5,2.5l/L尿素,100l/LNal,5l/L巯基

11、乙醇,1l/LEDTA重复洗涤3次,直至离心后的上清液澄清为止.最后用包涵体洗涤液(50l/LTrisHl，pH8.5,1l/LEDTA)洗涤1次后离心，离心条件不变.1.2.6表达产物变性条件下的纯化经洗涤的包涵体以100g/L溶于缓冲液50l/LTrisHl，pH8.5,5l/L巯基乙醇,1l/LEDTA,8l/L尿素中,4搅拌过夜,12000g4离心30in,搜集上清,即为目的蛋白粗提液.SepharylS300凝胶柱为1.680,以工作液(8l/L尿素,50l/LTrisHl，pH8.5,1l/LEDTA，100l/LNal)充分平衡后,目的蛋白粗提液2L上柱,以工作液洗脱,流速1L/

12、in,分步搜集并测定蛋白质含量,以SDSPAGE确定目的蛋白所在位置,搜集纯度较高的洗脱组分.1.2.7表达产物的复性以工作液(50l/LTrisHl,1l/LEDTA，100l/LNal，pH8.5)充分平衡后,取SepharylS100凝胶(1.660)过滤目的蛋白样品，用SepharylS300凝胶柱工作液调整蛋白样品浓度为20g/L,用蛋白复性液(50l/LTrisHl,1l/LEDTA,100l/LNal,1.25l/LGSH,0.25l/LGSSG,pH8.5)洗脱，流速0.5L/in,分部搜集,测定蛋白质含量,SDSPAGE确定目的蛋白所在位置,搜集纯度较高的洗脱组分,目的蛋白洗

13、脱峰直接对水透析，4，24h，其中换液3次.透析后样品于4，12000g/in离心30in，冻干上清，搜集样品.HPL检测蛋白纯度.1.2.8表达产物esternblt鉴定目的蛋白经SDSPAGE转移至硝酸纤维素膜,以10g/LBSA室温封闭过夜后,用小鼠抗人R5Ab(11000稀释)孵育膜,室温3h，TBST洗膜310in,再以HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(11000稀释)孵育膜,室温3h;TBST洗膜3次,用DAB显色液显色510in,观察结果.2结果2.1重组表达质粒的鉴定重组表达质粒pET22b(+)/rR5经限制性内切酶Nde和Sal酶切鉴定，得到的片段与预期大小相一致.质粒测序结

14、果与理论设计完全一致图1.2.2目的蛋白的表达在14ku处有明显的新生条带，和目的蛋白质预测的分子质量一致图2，说明在大肠杆菌中这种重组蛋白质的表达成功.薄层扫描显示目的蛋白表达量为30%.图1重组质粒pET22b(+)/rR5酶切鉴定图2目的蛋白在大肠杆菌BL21中的高效表达图3SepharylS300凝胶过滤洗脱图谱2.3工程菌的发酵及目的蛋白的纯化经工程菌发酵，收菌量约为40g/L.图3中最顶峰为SepharylS300凝胶过滤目的蛋白质所在峰.经考马斯亮蓝染色后,凝胶上除目的蛋白质带外不存在其他条带,薄层扫描显示目的蛋白质纯度达90%以上.图4为SDSPAGE分析结果.图4Sephar

15、ylS300凝胶过滤后洗脱峰SDSPAGE结果分析2.4目的蛋白的复性目的蛋白样品经SepharylS100凝胶柱复性后，SDSPAGE分析结果如图5.图5复性后rR5的SDSPAGE分析2.5esternblt鉴定诱导表达的菌体和纯化的蛋白在14ku处出现一明显条带，相对分子质量与理论计算值相符合，而对照菌体未出现显色带图6，说明该表达产物能与R5Ab特异性结合.3讨论AIDS主要由HIV1病毒感染并在体内快速繁殖，导致宿主白细胞的大量破坏所致.传统的以HIV病毒为靶向的疫苗设计由于其高变异性致使治疗以及预防AIDS均未获得很好的效果.鉴于R5特定突变基因型具有抗HIV感染的才能，其功能的减

16、弱和缺失对机体并没有太大的影响，多种影响R5表达或干扰R5功能活动的药物,如应用R5小分子拮抗剂、R5抗体、siRNA、反义RNA、核酸酶等，均可在一定程度上通过降低细胞外表R5数量进而降低HIV进入白细胞的速率.因此R5可作为一种可利用的新的靶点来进展HIV疫苗设计和药物开发5.图6目的蛋白rR5的esternblt鉴定我们在设计R5自体蛋白分子的过程中，考虑到R5作为七次跨膜受体，在与HIV结合发挥辅助受体功能的过程中，胞外4个片段均发挥相应的作用.应用计算机对R5抗原表位进展预测,发现抗原表位主要位于NTer和EL2,也是R5发挥辅助受体功能的两个主要片段，但为使自体疫苗诱导的抗血清更好

17、地阻断HIV与R5受体的结合，我们截取R5胞外4个片段用Linker连接，模拟R5受体膜外构造用作自身抗原分子.实验中，目的蛋白是以包涵体形式存在，包涵体的纯化和复性一直是蛋白质纯化中的一个普遍性难题，由于R5是一个跨膜分子，因此对重组目的蛋白的纯化和复性相比照拟困难，在尝试了几种蛋白质纯化和复性方法的根底上，总结了rR5的蛋白质纯化方案，即在确定目的蛋白质以包涵体形式存在的根底上，首先挑选高表达的菌种，其次优化表达条件和发酵工艺.采用溶菌酶和超声双重裂菌，对包涵体充分洗涤后，应用适当的变性剂浓度溶解包涵体，选用适宜的凝胶孔径，应用凝胶柱层析成功地对蛋白质进展了纯化和复性.此方法可以借鉴到分子

18、质量相近的蛋白质的纯化和复性.应用凝胶柱进展重组蛋白的纯化和复性，方法简单实用，且经济费用较低，为大规模消费重组蛋白奠定了根底.在自体疫苗的构建过程中，常常引入一些蛋白载体或特定多肽借以进步抗原分子的免疫原性，来打破机体的免疫限制，诱导出特异的高滴度抗体.结合文献和以往构建疫苗抗原试验的结果，我们拟在今后的实验中应用不同的蛋白载体耦联rR5免疫动物，以进步重组R5抗原分子的免疫原性.【参考文献】1AthisnREJ,GslingFS.ultipleextraellulareleentsfR5andHIV1entry:DissiatinfrrespnsethekinesJ.Siene,1996，274:1924-1926.2AgraalL,VanHrnAZ,EdardA,etal.Speifiinhibi