疟原虫抗药性的遗传学研究进展

1、疟原虫抗药性的遗传学研究进展关键词：疟原虫属；抗疟药；抗药性；基因摘要疟原虫产生抗药性是疟疾防治中遇到的主要难题之一。抗叶酸类抗疟药的抗药性机制已根本搞清，与其作用靶酶二氢叶酸复原酶或二氢蝶酸合成酶基因点突变相关。喹啉类药物抗性影响因子尚不完全清楚。恶性疟原虫5号染色体上的多药耐药基因1及7号染色体上的g2基因可能是抗性相关基因，但二者都不能完全解释抗性，尚待深化研究。疟疾的流行至今仍然非常广泛，普及全球90多个国家和地区，20亿人面临感染疟疾的危险。据统计，全球每年有3亿5亿疟疾病例，导致150万270万人死亡，其中100万是居住在非洲的5岁以下儿童1。人类在长期理论过程中挑选了大量防治疟疾

2、的药物，但是，自从50年代末在东南亚和南美洲分别发现恶性疟原虫对氯喹产生抗药性以后，抗氯喹恶性疟迅速扩散蔓延，抗药性程度不断增加，并且从单药抗药性向多药抗药性开展。我国的海南、云南和广西等盛自治区也有抗药性疟疾的流行。目前，疟原虫对几乎每一种抗疟药都产生了抗性，疟疾防治形势非常严峻，迫切要求我们尽快搞清抗药性产生的机制，以便采取措施防止或逆转抗药性的发生并指导新药研究。近年来，分子生物学技术的开展及学科浸透大大推动了疟原虫抗药性机制的遗传学研究，本文就抗叶酸制剂及喹啉类药物抗性的分子机制作一综述。1抗叶酸制剂抗性的分子机制1.1二氢叶酸复原酶DHFR基因乙胺嘧啶和环氯胍都是二氢叶酸复原酶抑制剂

3、。研究说明，恶性疟原虫对两药产生抗药性都与DHFR基因点突变相关，但二者存在差异2,3。迄今为止，共报道了6个DHFR基因编码区变异：108位SerAsn或Thr,51位AsnIle,59位ysArg,16位AlaVal,164位IleLeu。单一点突变所致DHFR108位Ser变异成Asn即可产生乙胺嘧啶抗性，但对环氯胍的反响性仅稍有降低。对乙胺嘧啶产生高度抗性那么需其他位点突变共存，包括51位AsnIle和或59位ysArg。而与环氯胍抗性相关的变异是DHFR108位SerThr伴随16位AlaVal，同样，该抗性株对乙胺嘧啶的敏感性变化不大。另外，在对乙胺嘧啶和环氯胍穿插耐药的恶性疟原虫

4、中发现存在多个位点变异：DHFR164位IleLeu,108位SerAsn,59位ysArg和或51位AsnIle。由于仅包含Asn-108和Arg-59变异的原虫别离物不具有环氯胍抗性，因此，认为Leu-164变异在疟原虫对两药产生穿插抗性的机制中起重要作用3。1.2二氢蝶酸合成酶DHPS基因磺胺类药是二氢蝶酸合成酶抑制剂。研究发现，正是由于磺胺类药作用的靶酶DHPS基因点突变，使得酶活性中心构造域形状改变，因此降低了对药物的敏感性。体外低叶酸条件下实验说明4，与磺胺多辛易感性降低相关的DHPS氨基酸变异主要包括581位AlaGly,436位SerPhe伴随613位AlaThr/Ser,以及

5、436位SerAla,437位AlaGly。磺胺多辛通常与乙胺嘧啶合用于治疗恶性疟疾。对两药联用的体外研究提醒，疟原虫对乙胺嘧啶的易感性决定着两药协同作用的效果5。体内研究也发现6，前面所述的DHFR变异类型均存在并与抗性程度相关，而DHPS基因突变与抗性的发生没有明显相关性，仅在抗性程度较高的玻利维亚地区可见Gly-581高度流行,Gly-437和Glu-540的发生与用乙胺嘧啶-磺胺多辛治疗失败率相当，这可能由于体外研究中叶酸和PABA程度不同于体内。另一种解释是Ala-436的变异可能仅在低度抗性时出现，且不与高度抗性时的变异Gly-437,Glu-540和Gly-581共存。因此推测，

6、DHPS变异在临床乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性的产生中不起主导作用。我们可以肯定，体内乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性与DHFR基因突变相关，然而在抗性疟流行区治疗失败率并不像突变发生率那样高，提示体外研究发现的三种变异Asn-108，Ile-51和Arg-59不能完全解释体内高度抗性。在玻利维亚的高度抗性病例中曾发现Leu-164及另外两个新的变异Arg-50和插入30-31位间的玻利维亚重复区高度流行，提示这些变异可能是在抗性开展的较高时期产生的，关系到治疗的成败。据此Ple等6提出假设，体内乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性程度分级R,R,R正是基于DHFR和DHPS基因突变的不断积累。由于现实中恶性疟原虫感染的复

7、杂性及宿主免疫与叶酸程度的影响，事实上所检测到的抗性突变往往是穿插重叠的。总之，关于抗叶酸制剂的抗药性分子机制已根本搞清。因此，我们可以根据特有的突变类型，运用分子生物学的方法，进展大规模的流行病学研究，这对于鉴定某一疟疾流行区的药物敏感性，从而指导临床用药具有重要意义；同时也可指导新药设计及临床药物联用，以最大限度地减少药物抗性的发生。2喹啉类药物抗性的分子机制氯喹曾经是使用最广泛的抗疟药，由于抗性的开展及传播，在大部分地区已不再具有以往的效力。影响抗性机理最终说明的重要因素是喹啉类药物作用机制还不非常清楚。不同地区的研究者报道关于氯喹抗性的一个共同特征是：抗氯喹虫株较敏感性虫株药物聚集程度

8、降低了。因此，氯喹的转运和聚集不仅对其发挥抗疟活性是必需的，而且与抗性表型亲密相关，提示喹啉类药物抗性产生可能与其作用方式没有直接关系，这与抗叶酸制剂不同。2.1恶性疟原虫多药耐药基因pfdr1和pfdr2研究发现，维拉帕米一种钙通道阻滞剂可逆转氯喹抗药性，促使人们考虑氯喹抗性可能与哺乳动物肿瘤细胞多药抗药性DR表型相似7。研究说明，肿瘤细胞产生DR是由于一种ATP依赖性的、与药物外排相关的蛋白过量表达所致，称为P-糖蛋白，它定位于细胞外表，与许多不同类型的化合物有亲合力8。在此根底上，Krgstad等9发现抗氯喹株原虫较敏感株排出氯喹的速率快4050倍，且这种排出是能量依赖性的，并可被能量缺

9、乏及ATP阻断剂抑制。但是也有研究显示,抗氯喹株与敏感株药物外排率相等10；二者药物聚集量的差异是由于最初的药物摄入速率不同所致11。哺乳动物DR表型通常伴有dr基因的扩增，导致其产物P-糖蛋白表达增加8。对恶性疟原虫基因的研究说明也存在dr基因同系物，以pfdr1和pfdr2为主12，13。目前尚无证据说明pfdr2及其表达产物与氯喹抗性有关，而有相当多的研究认为pfdr1与抗药性机制相关。Pfdr1编码一个相对分子质量约162的蛋白，称为P-糖蛋白同系物1Pgh1。早期研究说明，在一些抗氯喹株中存在pfdr1扩增12，13。免疫荧光及免疫电镜技术观察pfdr1蛋白产物，发现Pgh1在红内期

10、表达，主要定位于食物泡膜上，这与它可能充当氯喹转运蛋白的角色一致，但是定量分析不能确认Pgh1过表达与抗药性相关14。Fte等15对pfdr1基因3多态性及等位基因变异分析说明，pfdr1突变与氯喹抗性表型相关，并提出存在两种类型抗性相关等位基因，一种可致单一氨基酸变异86位AsnTyr，为K1型；另一种那么导致三种氨基酸变异，1034位Serys、1042位AsnAsp和1246位AspTry,为7G8型。这可能分别代表着最早在东南亚和南美洲出现的氯喹抗性类型。以此为根底，运用单盲法研究，曾正确地预测了36份样品中的34份的药物易感性。Adagu等16的研究也说明86位Tyr突变与氯喹抗性相

11、关。但是，同时有些研究不能得到一样的结果。这提示可能pfdr1不是唯一的控制抗性的基因。氯喹抗性与pfdr1的关系尚不明确，从选自氯喹抗性亲代的甲氟喹抗性株中却发现有pfdr1的扩增，并且虫株对甲氟喹抗性增加的同时对氯喹的易感性增加了12。Barnes等17的研究说明，随着原虫对氯喹抗性的增加，pfdr1基因拷贝数减少，甲氟喹易感性增加，这无疑加强了pfdr1扩增与甲氟喹抗性的关联。因此推测pfdr1扩增可能与氯喹高度抗性是不相容的，Pgh1的功能可能是促进对氯喹的易感性。将pfdr1基因转染于异源表达系统中国仓鼠卵巢细胞H，使其表达恶性疟原虫Pgh1，发现Pgh1表达伴随有能量依赖性的药物摄

12、入增加18，而且Pgh1就定位于转染的H细胞溶酶体上，经测定，发现转染细胞溶酶体内pH值有所下降，认为氯喹聚集增加可能是溶酶体酸化的结果，推测pfdr1可能编码一种液泡氯化物通道。当H细胞被携带有7G8型1034和1042位突变的pfdr1基因转染时，那么发现氯喹易感性丧失，细胞聚集药物及酸化溶酶体的才能减弱，这就从某种意义上证实了关于Pgh1促进氯喹易感性的推测。但这仍缺乏以解释抗性。Rithie等19发现源自氯喹抗性亲代的卤泛曲林抗株表现对卤泛曲林、甲氟喹和奎宁敏感性降低而对氯喹敏感性增强，却未检测到任何pfdr1基因序列或拷贝数及Pgh1表达的变化。很明显，关于pfdr1与喹啉类药物抗性

13、的关系仍有很大疑问，可能抗性的发生有一定的地理学根底，而寻找某个单一的基因来解释抗性本身过于简单化，氯喹抗性发生的缓慢及复杂性也不支持单基因决定抗性的假设。2.2g1基因和g2基因早在90年代初，elles等20从一次遗传杂交试验中发现疟原虫抗氯喹表型以孟德尔方式遗传，亲代pfdr1基因不与子代药物反响表型别离。对杂交子代进一步观察发现氯喹抗性表型与恶性疟原虫7号染色体上约400kb的区域相关而不是5号染色体的pfdr1基因。这一区域包含80100个基因，对该区域进展大量的分析研究后21，确定36kb的片段与氯喹抗性表型相关，并鉴定了2个候选基因：g1和g2。对采自东南亚和非洲大量的抗氯喹株检

14、测结果说明，g1尤其是g2基因多态性与氯喹抗性显著相关，但不排除g1与g2协同参与了抗性。不过，对南美洲抗氯喹株的检测没有得到同样结论。运用免疫电镜技术观察到G2蛋白定位于原虫周围液泡、食物泡及囊泡构造形成的外膜复合物上，暗示G2可能是一种转运蛋白。然而检索序列数据库未发现G2与任何离子通道或转运蛋白同源。Sanhez等22认为在氯喹抗性过程中，有转运分子在起作用，一个Na+/H+交换蛋白NHE可能调控着氯喹的摄龋已证实恶性疟原虫以一种热敏感的可饱和的方式主动摄取氯喹，并可被高等真核生物NHE的特异性抑制剂氨氯吡咪竞争性抑制。运用与Su等同样的亲代子代克隆研究发现，氯喹抗性表型与恶性疟原虫NHE的生理生化特征有遗传学关联。因此，Sanhez等23推测恶性疟原虫g2基因可能编码Na+/H+交换蛋白，他们认为两者可能有共同的构造和功能，比方氨氯吡咪结合位点、与NHE离子交换区同源等。但是，elles等24详细分析了G2蛋白序列，不支持上述观点。首先，尽管G2序列有一些疏水性氨基酸，却没有整合膜蛋白的典型特征，疏水性与跨膜区域分析说明，NHE与G2有显著差异。其次，G2与NHE离子交换区域不具有同源性，Sanhez等提出的G2有氨氯吡咪结合位点也没有可靠的根据。此外，假如G2是一种整合膜Na