活细胞骨架染色：实时观察3D细胞培养微环境与细胞迁移的互作用-雷萌生物

1、活细胞骨架染色-实时观察3D细胞培养微环境与细胞迁移的互作用2D细胞外基质（ECMs）的物理特性会影响到细胞的粘附动态和形态，但是3D细胞外基质的局部微环境对细胞的影响却知之甚少。美国的科研人员构建了几种3D胶原基质，研究其微结构的变化对于调节3D状态下的细胞粘附动态和细胞迁移的影响。细胞外基质中有各种成束的纤维会加强局部可粘位点的坚固性，并且可以通过ECM/粘附偶联点增强细胞的粘附稳定性，并且高度柔软的网状联合促进了粘附的收缩力。3D粘附的动力学由局部的ECM的强度和整合素/ECM还有II型肌球蛋的收缩白共同调节。不同于2D迁移，3D的细胞迁移不仅受ECM孔径大小影响。科研人员需要观察活细胞

2、的在成束的纤维中细胞前沿的突出点的形态变化，和细胞运动的轨迹。使用LifeAct标记细胞的F-actin能够不影响细胞功能和行为的情况下对细胞进行观测。研究人员发现细胞会将细胞前进的边缘沿着成束的纤维长边移动。具有接触导向的作用，这一点在纤维和细胞前进边缘平行时尤为明显。而纤维母细胞在不同的ECM中也显示出了类似的特性，是将纤维拉向细胞自身的同时将伪足向前延伸，并迁移的。Local3Dmatrixmicroenvironmentregulatescellmigrationthroughspatiotemporaldynamicsofcontractility-dependentadhesion

3、sAndrewD.Doyle，NicoleCarvajal,AlbertJin，KazueMatsumoto&KennethM.YamadaNatureCommunications6,Articlenumber:8720doi:10.1038/ncomms（giftfromNIDCR/NIH（giftfromNIDCR/NIH）（ibidi，Germany）（Hyclone）（Hyclone）（GIbco）（Millipore,1:200,Cat#ABT-123）（Bio-RadGenePulsarTM）1）细胞：fibroblast2）试剂：LifeAct-TagGFP2质粒Phenolre

4、d-freeDMEMFBSL-glutamineAnti-collagenI3）仪器：电转仪（二）实验步骤1、LifeAct-GFP转染使用0.4cm的电击杯，设定电压为170V,960uFd，持续时间17-22“s。2、collagenI预染5ml的3mg/ml的collagen1在室温固化之后，胶置于50mM的硼酸盐缓冲液（pH9.0）中孵育10min室温避光条件下使用灌流管逐渐用含有NHS脂染料的硼酸盐溶液逐渐替换之前的缓冲液并孵育1小时。保持染料一直处于灌流的状态，并且在孵育用TRIS溶液冲洗10分钟，并用PBS冲洗数小时移除没有结合的染料使用200mM的盐酸溶解已凝固的胶知道所有的胶溶解以1:1000的比例用20nM的冰醋酸透析上述胶溶液4小时实验前，用标记过的collagenI替换2-4%的未标记的collagenl,并和细胞混匀，开始试验。（三）实验结果03一0.丄0出60_0003一0.丄0出60_000612182430Time(min)3642如图所示：表达EGFP-LifeAct的fibroblast（绿色或灰色）在FB4ECM（红色）中的活细胞成像实验。从时间序列的拍摄结果可以看出，细胞一直是沿着纤维的方向，将actin富集到细胞的