氨氧化微生物总结

1、氨氧化微生物的研究这篇文章是本人通过查阅文献总结。氮循环在整个地球生态物质循环中起着重要的作用，其中微生物在地球氮循环中扮演着关键的角色。，但目前为止，微生物氮代谢机制依然存在许多未解之谜。本文通过氨氧化微生物的发展历史，现状进行了大致的概括，并进一步概述了氨氧化微生物的生理特性，且对今后的氨氧化微生物研究重点进行了一定的展望。氮循环是描述自然界中氮单质和含氮化合物之间相互转换过程的生态系统的物质循环。微生物在其中发挥了主要作用。氮循环主要由固氮、氨化、硝化、反硝化等过程组成。目前，氮化合物引起的水体污染和富营养化日益加剧，已经造成了生态破坏、资源匮乏、水环境污染等严重后果。生物脱氮技术能够有

2、效地去除污染水体和富营养化水体及底泥环境中的氮素，具有十分重要的意义和极大的实用价值。生物脱氮的理论基础是微生物作用下的硝化作用和反硝化作用。硝化作用作为自然界氮循环的重要环节之一，是指nh4+或nh3被氧化为no2-至no3-的一系列生化反应。亚硝化作用则是硝化作用从nh4+或nh3到no2-的反应过程，是氮素循环的重要环节,由氨氧化细菌(又被称为初级硝化细菌)、亚硝化细菌来完成。从氮转化的角度来看，亚硝化细菌在生态圈中居于重要地位,它们转化无机氨态氮为亚硝酸盐氮，与氨化细菌、硝化细菌等其它微生物共同作用，推动氮素循环的不断进行。作为生物脱氮硝化阶段的重要限速步骤，受到广泛关注。在第一株氨氧

3、化细菌(Ammonia-oxidizingbacteria，AOB)被成功分离的一个多世纪里，AOB都被认为是唯一具有氨氧化能力的微生物，直到21世纪初，古菌氨单加氧酶a亚基基因(Ammoniamonooxygenasea-subunit，amoA)的发现以及氨氧化古菌NitrosopumilusmaritimusSCM1的分离培养，才使好氧氨氧化微生物从细菌域扩展到古菌域。氨氧化古菌(Ammonia-oxidizingarchaea，AOA)的发现，重新激起了人们对氨氧化微生物的研究热情。目前，在土壤、湖泊、河口、深海、污水处理池等多种环境中均发现了大量AOA和AOB的16SrRNA基因、a

4、moA基因。AOA和AOB的研究对环境保护、工农业生产等都具有重要意义。虽然好氧氨氧化微生物的生理学、生态学、基因组学、蛋白质组学等方面的研究使我们对它们有了一定了解，但由于研究方法的限制及其分布的复杂性和对环境胁迫的敏感性，目前仍无法确定AOA和AOB对全球氮循环的相对贡献，也尚不清楚如何调控它们的活性使其在生态修复、废水处理等方面发挥重要作用。其生理生态学差异将有助于我们进一步研究不同环境中AOA和AOB的群落组成和活性，但目前很少有文章将两者进行比较。氨氧化微生物1.1好氧氨氧化微生物1.1.1氨氧化古菌2008年，科学家们通过系统发生学和酶学分析，将包括氨氧化古菌在内的部分泉古菌类群重

5、新划分成一个新门奇古菌门。根据16SrRNA和amoA基因的系统发育分析，目前已知的AOA划分为groupI.la、groupI.lb、ThAOA和groupI.la-associated四个类群。N.maritimusSMC1是第一株分离培养的氨氧化古菌，属于groupI.1a类群，它的发现使古菌的氨氧化功能得到证实，是好氧氨氧化微生物研究的重要里程碑。之后，人们又成功地从贫瘠土壤、淡水沉积物、农田等多种环境中富集了groupI.1a菌株。最近，从地热温泉中富集的Nitrosotenuisuzonensis扩大了我们对这类AOA分布的认识。2008年，第一株groupI.1b氨氧化古菌Nit

6、rososphaeragargensis从热泉微生物席中被分离培养。随后又有多株groupI.1b中的AOA被富集或分离，其中NitrososphaeraviennensisEN76是第一株从土壤环境中分离培养的AOA，它的纯培养为在土壤环境中广布的groupI.1b类群古菌的研究提供了模式生物，是中温古菌研究的又一里程碑。Nitrosocaldusyellowstonii则代表了在高温环境中广泛存在的一个分支嗜热AOA类群ThAOA。2011年富集到的Nitrosotaleadevanaterra是目前唯一的专性嗜酸氨氧化微生物，隶属于groupI.1a-associated类群。酸性土壤约

7、占无冰陆地表面30%,并且其中的硝化反应速率较高，是研究全球氮循环不可缺少的一环，所以这个发现为进一步研究氮的生物地球化学循环提供了重要条件。除了上述已分离或富集培养的AOA之外，基于amoA基因克隆文库的分析表明，自然环境中还存在大量未知AOA。2012年Pester等将从NCBI、IMG/M以及Camera3个数据库中获得的所有古菌amoA序列用距离矩阵法、最大简约法和最大似然法3种方法建树，划分为5个簇，其中Nitrosopumilis、Nitrososphaera、Nitrosocaldus、Nitrosotaleacluster分别对应已知AOA分类中的groupI.la、group

8、I.lb、ThAOA和groupI.la-associated类群，而Nitrososphaerasistercluster类群中还未有AOA被描述。Nitrosopumiliscluster在海洋水体和沉积物AOA中占主导地位，而Nitrososphaeracluster则主要存在于土壤以及潮间带、河口等低盐环境中。1.1.2氨氧化细菌目前为止，已知的AOB均属于卩-变形菌纲的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)和丫-变形菌纲的亚硝化球菌属(Nitrosococcus)。Purkhold等根据16SrRNA基因的系统发育树将卜变形菌纲中的AOB

9、分为10个簇。Avrahami等根据amoA基因系统发育树将卜变形菌纲中的AOB分为12个簇,其簇与16SrRNA基因系统发育树中的相对应，并新增加了Nitrosospiracluster9-12。2010年Dang等又在此基础上新划分出3个簇Nitrosospiracluster13-15。其中，Nitrosospiracluster2、3、4、10、11、12及Nitrosomonascluster7是土壤中主要的氨氧化细菌类群，土壤酸度及氨浓度是影响其分布模式的主要环境因子。Nitrosomonascluster6a则是淡水生态系统、废水以及生物滤池中的主要类群,在河口和近岸等受淡水、废

10、水影响较大的低盐环境中也有发现。海洋环境中存在大量Cluster13-15氨氧化细菌类群：Cluster13主要分布在近岸海洋环境中；Cluster14在近岸和深海的高盐度环境均有发现；而Cluster15则主要存在于近岸和河口，特别在河口环境中尤为常见。由于缺少相应已培养的AOB，Cluster9-15在16SrRNA基因进化树上还无法找到与其对应的分支，需要通过更多的纯培养AOB和克隆序列来进一步确定。在已纯培养的AOB中，Nitrosomonaseuropaea作为研究好氧氨氧化微生物生理、生化和系统发育等方面的模式生物之一，是目前研究最多的氨氧化微生物。Nitrosococcusoce

11、ani是丫-变形菌纲中唯一在海洋环境中广泛存在的种。2014年,Urakawa等又定义了一个新种Nitrosospiralacus，其标准菌株APG3分离自淡水湖沉积物，是一株耐寒、广pH的陆源氨氧化细菌。这种具有独特生境选择的AOB为自然界中氨氧化微生物的微生物生态学研究提供了新的认知。1.2厌氧氨氧化微生物厌氧氨氧化菌种类到目前为止，科学家已经从淡水、海水中找到了6种属的厌氧氨氧化菌。从而也证明了厌氧氨氧化细菌广泛存在于自然环境中。将其按盐度可分为淡水氨氧化菌和海水氨氧化菌。将其按生长特性可分为自养氨氧化菌和异氧氨氧化菌，厌氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation,A

12、nammox)菌为自养型细菌，可在缺氧条件下以氨为电子供体，亚硝酸盐为电子受体，产生N2。已发现的厌氧氨氧化菌均属于浮霉状菌目(Planctomycetales)的厌氧氨氧化菌科(Anammoxaceae)，共6个属，分别为CandidatusBrocadia、CandidatusKuenenia、CandidatusAnammoxoglobus、CandidatusJettenia、CandidatusAnammoximicrobiummoscowii及CandidatusScalindua。其中，CandidatusScalindua发现于海洋次氧化层区域，称之为海洋厌氧氨氧化菌，其余5个

13、属均发现于污水处理系统中，称之为淡水厌氧氨氧化菌。厌氧氨氧化细菌对全球氮循环具有重要意义，也是污水处理中重要的细菌。表1厌窜氟氧化菌种类CLriiiiLlitsl3nMdiiaittimiihmiilnrCjiiHlidjlu.kuriNiii;-ikIiillisudirtfiHTTST-器imrni-liir；4iniiiiHliuiiiiJixiiLg自莽LLi111h：iri1lllXk-MHII4HU1.S11Jlll|llll代谢途径2.1氨氧化在AOB中，AMO催化氨的好氧氧化生成羟胺，羟胺被周质的羟胺氧化还原酶(Hydroxylamineoxidoreductase，HAO)氧

14、化成亚硝酸盐。具体反应如下：(1)2H+NH3+2e-+O2NH2OH+H2O；(2)NH2OH+H2ONO2-+4e-+5H+o其中第二步生成的电子中有两个电子用来补偿第一步反应，剩下的两个电子经过电子传递链传递到末端氧化酶从而形成质子动力势；(3)2H+l/2O2+2e-fH2O(图A)。对于古菌N.maritimus的氨氧化作用化学计量学分析表明其产生亚硝酸根所需的氧气和氨的相对量与AOB的相似，它们总反应式为NH3+1.5O2NO2-+H+H2OoVajrala等通过稳定同位素示踪法发现N.maritimus的氨氧化过程中有NH2OH的产生和消耗并且伴随着能量的产生，证明羟胺是其氨氧化

15、过程的中间产物，AOA中的氨氧化过程可能与AOB相似，但是目前AOA的具体氨氧化过程尚未探明。在已知的AOA的基因组中还没有发现类似于AOB中的羟胺氧化还原酶基因hao,可能在AOA中存在未知的酶可代替HAO氧化羟胺。另外，也有观点认为古菌的AMO或其他酶催化反应可能产生HNO，HNO被硝酰氧化还原酶(Nitroxyloxidoreductase,NxOR)氧化生成N02-。而且与AOB相比，AOA中没有细胞色素c基因而是存在大量编码多铜氧化酶和质体蓝素域蛋白的基因，这表明AOA的电子传递机制与AOB不同。(图1是推测)0H+HjOHemeCytoplasmPeriplasm.厂HemeNHa

16、0H+HjOHemeCytoplasmPeriplasm.厂HemeNHaOH+H30-Nitrite+目*CytCmB&2Oj+4H+HCO2UQH22ua4H+CytC55434,35NifritReductionCarnexlC&malfiAllNifritReductionCarnexlC&malfiAll5耐笛I甲3创|汕Fig.1.PraposdAOArespirator)-pathwayTextindbcatesthectescrib-Klpo如bbhydraxyhmineIbkjetertandarrows.)andnitrnxyl(gmnpathways.RedarrawHi

17、ndicatedectranflowmotinvolvedinamnwidoxidation.BlueshadingdenotesblueooDwr-ontainingproteins.Pinkbsxindicatespossiblealternatrresairaterj/eleclronHe*的orecontainingQandQH2presenttheoidisdjndeducedquinone欣忆resiKrtily-图1;可能的AOA呼吸通路文本描述的是可能的羟胺(蓝色的文字和箭头)和亚硝基(绿色)通道。红色箭头表示没有参与氨氧化的电子流。蓝色的阴影表示蓝色的含铜蛋白。粉红色的盒子表

18、明可能的替代呼吸电子库。含有Q和QH2的六边形分别代表氧化和还原的醌池。2.2固碳通常认为氨氧化微生物是能利用氨作为唯一能源、以CO2作为主要碳源的化能自养微生物，但是AOA和AOB在固碳方面存在重要差异。AOB通过卡尔文循环固碳，每固定1分子的CO2需消耗3分子的ATP和2分子的NADPH,据估计其产生的能量80%用来固碳。而AOA基因组中包含乙酰辅酶A/丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A差向异构酶和变位酶、4-羟基丁酸脱氢酶等酶的编码基因，通过3-羟基丙酸/4-羟基丁酸(3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate，3HP/4HB)途径固碳。研究表明，AOA固

19、定CO2的方式最节能，固定等量CO2所消耗的能量是AOB的2/3,比拥有相似固碳途径的泉古菌消耗的能量还要低,这为它们在寡营养环境中生存提供了条件。不同的固碳途径对氨氧化微生物生态适应性有重要影响：3HP/4HB途径中固定的是HCO3-，而HCO3-是海洋环境中主要的碳素存在形式，这为AOA在海洋中的广泛分布提供了条件；而卡尔文循环固定的是CO2，且在AOB的基因组中有碳酸酐酶编码基因，可以将HCO3-转化成CO2，因此AOB利用的无机碳源范围更广。2.3产N2O研究表明AOA和AOB都能产生N2O。在AOB中主要通过2种途径生成N2O：在有氧条件下，羟胺在HAO的作用下氧化成NO,进而形成N

20、2o；在低氧条件下，AOB主要通过硝化菌反硝化作用在亚硝酸盐还原酶的作用下将亚硝酸还原成NO，再经一氧化氮还原酶(Nitricoxidereductase，NOR)还原成N2O。与AOB不同，目前对于AOA产生N2O的代谢过程仍然存在争议，因为在AOA的基因组中既缺少类似于AOB中的hao基因，又缺少参与硝化菌反硝化作用的nor基因。Loscher等研究表明AOA可通过未知的中间产物在氨氧化过程中产生N2O。Jung等通过同位素示踪证明土壤AOA富集物产生的N2O存在N2O、N2O、N2O3种形式，它们可能分别由氨氧化、硝化菌反硝化作用及两个代谢途径结合产生。而纯培养的N.viennensis

21、可能通过混合形成机制产生N20,在这个过程中来源于亚硝酸的N原子与来源于氨或者氨氧化作用中间产物的N原子通过酶学反应结合生成N20。具体过程如图2所示。AOA和AOA和AOB产N2O的途径Figure2PathwayleadingtoN2Oproductionof图2AOAandAOB(modifiedfrom)2.4厌氧氨氧化的可能反应机理在厌氧氨氧化反应中，目前假设的机理为以亚硝酸盐作为电子受体，氨氮作为电子供体，直接转为氮气。具体过程为N02-在亚硝酸盐还原酶的作用下被还原成NH2OH产生5个质子，然后nh3和nh2oh在细胞质内被一种膜包裹的联胺水解酶（HH）催化氧化为N2H4,在细胞

22、质内联胺氧化酶（HZO）继续把N2H4转化为N2。其中N2H4的4个电子被由细胞色素C作为电子载体传递给辅酶Q，紧跟着由细胞色素bcl再将其传给联氨氧化酶和亚硝酸还原酶（NR），于是开始新一轮的厌氧氨氧化。联胺氧化酶（HZO）是一种负责将NH3氧化成N2的酶。这些电子结合了亚硝酸盐还原酶，把N02攝初转化为羟胺。因为厌氧氨氧化反应受到02的强烈但可逆的抑制，所以不可能由AMO（氨的单氧化酶）产生NH2OH。厌氧氨氧化型新陈代谢发生在厌氧氨氧化体中，它是一种由梯状含脂膜包裹成的内隔间，它至今只有在厌氧氨氧化细菌中发现。通过该模型还可以看出，在厌氧氨氧化过程中细胞质中的质子不断被消耗，厌氧氨氧化体内不断产生质子。在这个过程中最终导致质子动力的积累，这种积累会产生一种质子驱动力P,最后通过三磷酸腺苷酶用于启动ATP。应用3.1好氧氨氧化应用好氧氨氧化过程常与反硝化或厌氧氨氧化等过程耦合产生n2,起