第五组-光镊技术的新应用

1、光镊技术的新应用纪美伶，白中博，王 娜，马学进（西安交通大学生物医学工程）摘 要 激光光镊自从1986年发明以来，作为一种无直接接触、无损伤、可产生和检测微小力以及精确测量微小位移的物理学工具，在生命科学等多个领域得到了广泛的应用。本文从光镊的诞生出发，简要讨论了光镊的原理，光镊装置的基本结构，并简要介绍了各个种类光镊的独特功能以及基于光镊的一些新技术，进而对光镊技术及其删除“及其”删除“及其”两字关键词 光镊；生命科学；原理；基本结构；应用现状；发展New Applications of Optical TweezerJi Mei-ling,Bai Zhong-bo,Wang Na,Ma X

2、ue-jinAbstract The optical tweezer technique has emerged as a flexible and powerful tool for exploring a variety of scientific processes such as life science since it was invented in 1986. From the birth of the optical tweezer, this paper will briefly discuss its working principle, its basic structu

3、re and introduce some kinds of optical tweezers with novel features or some new technologies based on it. Then its recent developments on both the technology and applications in life science will be reviewed. It is shown that optical tweezer will have great potential in life science.Key words：optica

4、l tweezer; life science; principle; basic structure; application; development光镊简介一百年前，爱因斯坦提出的光量子学说最终导致了激光的诞生，20世纪60年代激光器的发明，使光与物质相互作用产生的力学效应真正走向实际的应用。20世纪70年代，美国贝尔实验室的学者Arthur Ashkin等人1发现了激光具有移动微粒的能力，并首先提出利用光压操控微小粒子的概念：在氩离子激光器发出的TEM00模式激光束作用下，氩离子激光器发出的TEM00模式激光束照射到硅小球上硅小球在此处加入“会在”两字横向梯度力的作用下陷入光束中心，然

5、后在光束散射力的作用下沿着光束传播的方向加速运动；还发现了折射率低于周围介质的粒子（气泡）会被激光束排斥，同时也会被激光束沿着激光传播的方向加速。此处句子删除其后 Ashkin 利用两束相对照射的TEM00模式激光去捕获改为“照射”高折射率粒子，发现粒子在激光横向梯度力的作用下陷入光束中心，然后沿着光束传播的方向运动到一个稳定的平衡点停止下来，这样粒子就被两束相对照射的激光束稳定捕获了。这时它还不能称之为光镊，因为只能实现氩离子激光器发出的TEM00模式激光束照射到硅小球上此处加入“会在”两字此处句子删除改为“照射”此处加入“对粒子”三字1971 年，Ashkin 和 Dziedzic 第一次

6、使用了单光束捕获粒子2。他们利用一束聚焦的 TEM00模式激光从下向上照射粒子，在轴向散射力的作用下粒子被顶起，同时粒子受到向下的重力作用。当粒子运动到平衡位置时，向上的散射力和向下的重力达到平衡，粒子在轴向上稳定下来。在横向上，由于光束的横向梯度力始终指向光束中心，因此粒子被稳定地捕获在光束中心。这样就形成了一个单光束悬浮光阱（opticallevitation trap）。此部分删除在1986年，Ashkin发表了一篇具有深远意义的论文3，标志着光镊的诞生。在此文中Ashkin仅仅利用一束激光就实现了在三维方向上捕获电介质粒子，而且在轴向上利用的是梯度力捕获粒子，而非利用重力作用的悬浮光阱

7、。实验中Ashkin利用高度聚焦的单光束焦点形成的单光束梯度力势阱（single beam gradientforce trap），在水中成功地捕获了直径从 25nm 到 10m 的电介质粒子，且在横向和轴向上所施加的捕获力都来自于光场梯度力。由于这种单光束梯度力势阱在轴向上的梯度力足够大，超过了散射力，占据了主导地位，加入“因此”形成了一个稳定的三维势阱，可以像一个镊子一样任意捕获并移动电介质粒子，可以改为“并且可以此部分删除加入“因此”改为“并且可以”近30年来光镊技术的研究和应用得到了迅速的发展，由于其在捕获操纵粒子时具有非接触性、无机械损伤、精确定位改为“且能够对粒子精确定位”等特点，

8、使光镊在各个领域，特别是生命科学领域，已成为研究单个细胞和生物大分子行为不可或缺的有效工具4，在生物分子的操控和生物分子的动力学研究方面发挥了重大作用，正逐步成为研究活体生物功能内在机制和疾病诊断、治疗的重要工具。改为“且能够对粒子精确定位”基本原理光具有能量和动量改为“光不仅具有能量，而且具有动量”，携带动量的光与物质相互作用时会有动量的传递，从而表现为光对物体施加一力改为“施加了力”，并由此引起物体的位移和速度的改变，加入“这种现象”称之为光的力学效应。如图1所示，一束激光被透镜聚焦后射到透明介质球上，经介质球两次折射后，光子动量发生变化，这种变化反作用于小球，表现为对小球的反作用力，该力

9、的大小正比于光的强度梯度，合力F方向指向光束焦点。这种由于光场强度分布不均匀而产生的力，称为梯度力。光镊是改为“正是”依靠光的梯度力形成的，当达到改为“在”焦点附近的梯度力大于散射力时才能改为“会”形成一个稳定的三维光学势阱来稳定地捕获生物粒子，这一稳定的三维光学势阱是由一束激光通过一个短焦距透镜汇聚来实现的。此句话删除由图1可知改为“还可得知”，无论入射光从法线之上还是之下入射小球，小球受到合力方向均指向焦点（改为“光不仅具有能量，而且具有动量”改为“施加了力”加入“这种现象”改为“正是”改为“在”改为“会”此句话删除改为“还可得知”此部分删除 图1 电解质小球的光捕获机理示意图4当光束a和

10、b经透镜折射，其折射光产生的力分别为和，合力F指向焦点。无论a、b两束光从法线之上（A）还是之下（B）入射，电解质小球所受合力方向均指向焦点此部分是图1的解释，不是正文内容此部分是图1的解释，不是正文内容基本组成装置光镊系统通常是由激光光源、激光扩束滤波光路、光镊移动控制环节、位移检测传感部分和传统光学显微镜组成，再配上CCD和计算机，用来观察、监测和记录实验过程5。光镊的简易结构如图2所示。图2 光镊实验装置简易图7 BE为beam expander，即激光扩束；MO，microscope objective，物镜；DM，dichroic mirror，分光镜，样品至于载物台上。激光光源为半

11、导体激光器，激光光束经显微镜内的一片双向分束器反射，进入100倍油浸物镜，再会聚到观测点上形成光镊。图像被一个极敏感的CCD摄像机准确的记录以及改为“并”传输到电脑端显示。样品池置于自动或手动操纵平台上，自动操纵平台由计算机控制其在三维方向以微米精度运动，通过控制自动平台使被捕获粒子相对于样品池移动，从而实现对粒子的操控，所有的观察和测量都是在实验室的室温下进行的8。此句话删除改为“并”此句话删除由光镊的基本装置可以看出，光镊对微粒的捕获和操作是无损的，不会干扰其正常活动，加入“加入“因此”光镊的分类经过近30年的发展改为“近三十年来”，光镊技术得到了极快的发展。由过去简单的单光镊演化出了许多

12、其他的类型，极大地扩大了改为“扩展了改为“近三十年来”改为“扩展了”多光镊系统（又称阵列光镊） 对于生物微粒，常常需要研究它们彼此之间的相互作用，因此为适应相关的复杂操控的需要，多光镊技术产生并发展起来。多光束光镊是指一次可以形成多个光阱，同时捕获并操纵多个粒子的光镊。与一次只能捕获一个微粒的单光束光镊相比，多光束光镊不仅可以同时产生多个光阱，同时捕获并操纵多个粒子，而且可以实时控制光阱的排列位置改为“方式”，大大提高了实验效率，且使入射在微粒上的激光强度分散，降低了光损伤的可能性。目前已有多种产生多光束光镊的方法，其中研究最多的、应用的最为广泛的方法是全息衍射法（全息光镊）和分时复用法（扫描

13、光镊）这两种方法此部分删除。改为“方式”此部分删除全息光镊全息光镊是利用光学衍射的方法产生多光点阵列。关键技术在于光学衍射元件（DOE）的应用。一般来说，用作全息光镊的光学衍射元件是空间光调制器（SLM）上加载的计算全息图（CGH），加入“空间光调制器”应用最多的是液晶空间光调制器。图3中的装置就是采用改为“采用的就是”反射式液晶空间光调制器。其基本原理是通过计算机产生的全息图加载到空间光调制器上，激光束经扩束准直后入射到空间光调制器上，经衍射被调制成为所需要的光强分布，再通过一个望远镜系统将光束收集进入显微物镜，在显微物镜的焦平面上得到所需要的光点阵列。每一个光点相当于一个光学势阱，从而可以

14、同时并行地捕获和操作多个微粒，加入“而且可以”通过编程改变全息图来改为加入“空间光调制器”改为“采用的就是”加入“而且可以”改为“进而”此句删除图3 全息光镊装置9根据不同的全息图记录方式，全息光镊有两种光路：菲涅耳型光路和傅里叶型光路，如图 4所示9-10。菲涅耳型光路使用的全息图是菲涅耳全息图，是在被照明物体的菲涅耳衍射区内记录的；傅里叶型光路使用的是傅里叶全息图，记录位置位于傅里叶变换平面。 （a） （b）图4 全息光镊的两种典型光路10-11：（a）傅里叶型光路；（b）菲涅耳型光路图5给出了 Jesacher 等人利用全息光镊产生的圆形、椭圆形、五边形、笑脸等一系列复杂光阱，并成功地捕

15、获了多个粒子，使其在光阱中做逆时针运动。图5 全息光镊产生的阵列光阱12-13从上到下：傅里叶平面光场分布、物镜焦平面光场分布、被捕获粒子在光阱中的运动方向分时扫描光镊技术全息光镊受空间光调制器透过率及衍射效率的限制，通常需要使用瓦级的大功率激光器才能产生足够强度的多光阱阵列。与之相比，分时扫描光镊由于采用单光束扫描删除在光束偏转器的作用下，在焦平面上快速扫描，以达到多光束的效果，所以光强损失小，可以使用较低功率的激光器。分时扫描光镊的核心部件是光束偏转器来实现改为“光束偏转器，用它来实现”光束的高速偏转。激光束经过偏转器在显微物镜的像平面上快速扫描，通过计算机控制光束的行走路径，也可以使激光

16、束在几个固定点之间快速切换。当光点在各个微粒上的作用时间大于最小停留时间，而离开时间小于粒子的布朗运动时间时，粒子可以被束缚在光点扫描路径上，排布成各种图案，或者在几个固定点上同时捕获粒子。通过控制光束的扫描速度，还可以使被捕获的粒子沿光束的扫描轨迹运动。删除改为“光束偏转器，用它来实现”图6 扫描光镊示意图14 分时扫描光镊的缺点是可同时捕获的粒子数目不多。当需要同时捕获的粒子数很多时，这种方法就不适用了。扫描光镊的另一个缺点是不能产生三维光点阵列。美国 Illinois 大学的 Timp 教授14对这种方法进行了改进，使用高速的声光偏转器产生2121的二维光点阵列，同时捕获了441个Pse

17、udomonas aeruginosa细胞。加入“特别地，”加入“特别地，” 图7 使用扫描技术与空间光调制器技术相结合产生的三维光点阵列捕获细胞15光纤光镊利用光纤传输激光具有在短程内损耗很低的优势，且出射的激光光场仍然呈现一定特性分布15。光纤光镊是指用光纤代替显微物镜形成会聚光束，用光纤头出射具有高度光强梯度分布的光束来捕获粒子的光镊16。与传统的光镊不同，光纤光镊不需要扩束镜对激光束扩束，也不需要显微物镜对激光束聚焦，捕获系统的光路与光学成像光路相互独立，且结构比较简单，光纤头通过机械装置控制，可以插入样品溶液中对粒子进行近距离的操纵，加入“加入“因此”光纤光镊两种改为“光纤光镊根据端

18、口形状分为两种”，如图8改为“光纤光镊根据端口形状分为两种” 图8 光纤光镊端口的两种形状。（a）平端面；（b）锥形自透镜端面。平端面光纤光镊的光纤头端面是与光纤垂直的平面，Constable等人17利用这种平端面光纤光镊首次成功地捕获了尺寸在 0. 1-10m 范围内的聚苯乙烯小球和酵母菌细胞。对于尺寸小于 1m 的粒子，其横向捕获能力比传统的光镊系统提高3-5个数量级，但是轴向捕获能力比较弱，捕获时需要使用两根光纤相对照射。锥形自透镜端面光纤光镊的光纤头端面经过精细打磨，形成逐渐变细的半球状或锥形，从该端面出射的激光束有一定的聚焦效果，改善了平端面光纤光镊轴向捕获力较差的问题。Taguch

19、i 等人18利用单根圆锥形头的单模光纤成功地捕获聚苯乙烯小球和酵母菌细胞。Masahiro 等人19利用三根锥形的光纤头实现了对杆形物体的旋转。通过改变三个光纤头不同的输出功率，可以任意控制杆形物体的旋转方向和旋转速度，如图9所示。 图9 三根锥形光纤光镊对感性物体的旋转20飞秒激光光镊飞秒激光是一种以脉冲形式运转的激光，持续时间非常短，只有几个飞秒，但具有非常高的瞬时功率，可达到百万亿瓦，它作用于物质的非线性效应强，热效应小，几乎不会伤害周围区域的生物组织，因而具有极高的空间分辨率20-21。天津大学首先提出了飞秒激光光镊的概念。他们提出飞秒激光光镊与连续光光镊不同的是在飞秒光镊中作用在粒子

20、上的光学梯度力是脉冲式23。在研究应用方面，瑞典 Malmqvist 等人23采用高平均输出功率的飞秒激光作为光镊光源，成功地捕获了非线性介质颗粒，同时还实现了二次谐波的产生。英国圣安德鲁斯大学的 Agate等人24采用飞秒激光光镊实现了对染料标记的聚合物小球的捕获，并且研究了小球的双光子荧光发射特性。国内也采用自行搭建的飞秒激光光镊实现了对人体血红细胞的稳定捕获，并做了许多飞秒激光捕获能力和其他方面的理论研究工作。比如，王清月领导的课题组以高重复率飞秒激光为光源对血红细胞、白细胞、聚苯乙烯微球、病毒等均实现了稳定捕获，并比较了飞秒激光与连续激光的捕获能力25。（4）特殊光束光镊 特殊光束光镊

21、是采用一些特殊模式的激光以产生特殊的捕获效果的光镊。通常采用比较多的有柱对称矢量光束、贝塞尔光束、涡旋相位光束、线形光束等。比如，普通的光镊对于折射率高于周围介质的电介质粒子的作用力是吸引力，而对折射率低于周围介质的电介质粒子的作用力是排斥力，因此只能捕获折射率高于周围介质的高折射率粒子。而方位角偏振光束（柱对称矢量光束的一种）聚焦时焦点处的光强分布呈现空心结构，如图10所示，所以采用此光束产生的空心光阱就可以把低折射率粒子囚禁在空心处26。图10 方位角偏振光束聚焦后的空心结构，可以用来捕获低折射率粒子26。普通的高斯光束并不携带轨道角动量，因此难以旋转粒子。Allen等人27利用方位角方向

22、变化的相位片（螺旋相位片）产生了 Laguerre-Gaussian 光束（LG 光束）。这种光束具有螺旋波阵面，携带轨道角动量。当 LG 光束与粒子交换角动量时，就可以使粒子发生旋转。图11给出了 Allen 利用角向变化的相位片把入射的TEM00光束变成具有螺旋相位的 LG光束，并实现驱动胶体粒子做圆周运动。图11利用方位角方向变化的相位片产生具有轨道角动量的螺旋相位光束用来旋转粒子28。TEM00高斯光束通过相位片变成具有螺旋相位的 LG 光束；螺旋相位光束聚焦后并非一点，而是一个光学涡旋，其半径与螺旋相位的螺距成比例；当单个胶体粒子陷入光学涡旋后，在轨道角动量的驱使下，粒子绕着中心做轨

23、道运动。采用方位角方向变化的相位片可以产生螺旋相位光束，利用径向变化的相位片可以产生一种具有沿光束传播方向保持光束直径不变的贝塞尔光束（Bessel beam）。贝塞尔光束的横向光场分布是同心圆结构。零阶贝塞尔光束的中心是一个亮斑，聚集了光束的大部分能量，可以用来捕获折射率大于周围液体的透明粒子。高阶贝塞尔光束的中心是一个暗斑，随着阶数的增加暗斑半径也随之增加，这个暗斑就可以看作是一个光学陷阱。对折射率小于周围液体的透明粒子或非透明的吸收型粒子，在这个陷阱中会受到指向暗斑中心的梯度力，从而被囚禁在暗斑中心。Garces-Chavez 等人28利用贝塞尔光束在轴向上同时捕获多个粒子，并且实现了把

24、粒子沿轴向推斥了很长一段距离（3mm），图12所示。图12 空间无衍射的贝塞尔光束可以再轴向上同时捕获多个粒子28纳米光镊生物大分子的尺度多为纳米量级，因此对它们的操控以及它们在动态过程中涉及的位移测量应达到纳米精度，相互作用力的检测也要达到皮牛（pN）量级。加入“为了”完成这样的研究目标，即在单分子水平上探索生命运动的规律，纳米光镊技术成长并发展起来，加入“并迅速加入“为了”加入“并迅速” 相比于传统光镊，首先纳米光镊所能操控的对象的尺度延伸到了纳米量级；其次是光镊阱位或改为“以及对”微粒的操控定位达到了纳米精度。更重要的是位移测量达到了纳米精度，但是在纳米光镊技术中生物大分子位移的测量是仍

25、然是通过测量光镊可操控的刚性“手柄”小球的位移间接测量的。因为光学成像方法分辨能力受波长限制，但改为“目前只有对”刚性小球这种尺度的定位精度可以达到纳米量级。最后，对生物分子间相互作用相联系的微小力的实时测量技术已经建立起来了。从飞牛（f N）到上百皮牛（pN），这种微小力的测量关键是力的标定。考虑到光阱中心附近，势阱很类似于简谐势，加入“改为“以及对”改为“目前只有对”加入“因此”加入“的大小” 加入“目前，”纳米光镊技术已基本成熟。因其在微观生物学研究中的重要作用，它改为“也加入“目前，”改为“也”加入“纳米”基于光镊的新技术（1）光致旋转 早期的光镊光镊只利用了光的线性动量，其实光在一定

26、条件下还带有角动量，光在与物质相互作用使光束的偏振态发生变化时，就会与物体或微粒有相应的角动量的交换，从而使物体发生转动，这种光的力学效应，称为光致旋转。光致旋转的方法有很多。主要有类风车微粒旋转法，圆偏振光旋转双折射粒子法，特殊激光模式法等。1）类风车微粒旋转法类风车微粒旋转法使用形状如风车状的微粒，其原理是利用光压的作用。光压力作用在风车状微粒上会产生扭矩从而使微粒旋转，其转速与光强成正比，旋转方向取决于微粒本身形状。这方面的研究以匈牙利科学院Ormos等31的工作为代表。这种光致旋转需要的特殊结构的微粒必须通过精密的微加工技术制作，成本较高。2）圆偏振光旋转双折射粒子法圆偏振光旋转双折射

27、粒子法的基本原理是：圆偏振光的每个光子具有大小为1h的自旋角动量，当其穿过透明的双折射微粒后，光束中光子的自旋角动量发生改变，根据角动量守恒定律，双折射微粒将从光束获得相应的角动量并产生围绕自身光轴的旋转。当微粒厚度相当于入射激光1/4波长的厚度时，产生的扭力矩达到最大值，而且左旋与右旋圆偏振光会分别导致微粒的顺时针或逆时针旋转。由于粒子对于光束是透明的，增加激光功率不会产生很高的热效应，可以实现很高的旋转频率。该方法的缺点是仅适用于双折射粒子而且对粒子的厚度有要求。澳大利亚昆士兰大学的Nieminen等人32用这个方法实现了双折射CaCO3的旋转，在激光功率为300 mW时（波长1064 n

28、m），最大旋转频率达到350Hz。图13为姚保利等人实验实现的CaCO3的旋转。图13 CaCO3微粒的光致旋转33使用线偏振光也可以实现某些微粒的光致旋转。例如碟状和棒状的微粒，当它们被捕获在线偏振光的光阱中后，其长轴方向总是与线偏振光偏振方向保持一致。这时，如果使用半波片连续改变线偏振光的偏振方向，微粒就会随之旋转。如图14所示，澳大利亚昆士兰大学Nieminen等使用此方法旋转了菠菜叶绿体34。 图14 菠菜叶绿体在线偏振光作用下的光致旋转34 上述几种光致旋转方法都对粒子本身的结构和形状有严格的要求，属于特殊粒子旋转法，不适用于任意粒子的光致旋转。而特殊激光模式法则可以实现对任意粒子的

29、光致旋转。它利用的是某些具有轨道角动量的特殊模式的光束，这种能使粒子旋转的光束被人们形象地称为光板手（Optical Spanner）。例如前面介绍的具有螺旋波阵面的拉盖尔-高斯光束（L-G），波阵面呈螺旋状，具有圆形截面，沿光轴光场强度为零。拉盖尔-高斯光束中每个光子都具有大小为lh的轨道角动量，当其照射到粒子上时，粒子可以吸收获得光束的轨道角动量，产生自转35-36。这种方法原则上适用于各种粒子，但转速高低取决于粒子吸收入射光轨道角动量的大小。增加入射光强有可能导致很高的热效应，而且由于吸收产生的轴向散射力也会影响光镊的捕获，从而限制了粒子的旋转频率。 利用圆柱状石英在光镊中形成的光扳手，

30、美国康奈尔大学的C. Deufel等人37观测了双螺旋DNA形成超螺旋结构时产生的扭力和相变的过程。比较上述几种光致旋转法可以看出，它们各有其优缺点和适用范围，在实际应用中应根据需要选择适合的方法。光致旋转技术可以用于驱动微机械装置，是实现微机械马达的有效手段。在细胞生物学中还可以用来研究旋转分子马达的特性。（2）光镊成像系统的设计与实现纳米光镊技术成为当前光镊技术发展的一个主要方向，对于纳米光镊技术，生物粒子的尺度为纳米量级，因此，必须发展相应精度的物理技术和方法，特别是生物粒子的精确操控与定位、位移测量和皮牛量级力的检测等，这些功能主要通过光镊成像系统实现。因此，设计合理的成像系统结构并增

31、强其数据分析处理能力是光镊技术发展中的重要内容之一。 周哲海等人53搭建了一套远场光镊和计算机控制的三维平移台，实现了纳米位移，并设计了光学成像系统，实现了高质量捕获粒子成像，并编写了一套图像处理软件，实现了粒子计数、位置测量及粒子圆度计算等功能。实验结果表明，该成像系统可实时获取捕获的纳米尺度微小粒子的位置及位移信息，为进一步实现皮牛顿力的精密测量奠定基础。系统主要由两部分组成，即实现粒子捕获的粒子捕获系统和实现捕获粒子成像及分析的成像系统。（3）光镊与其他技术结合光镊作为一种光学技术，很容易与其他光学技术耦合，从而具有更完善的功能，成为更加强大的组合研究工具。光镊与激光光刀的结合激光光镊用

32、作光学微机械手，用来实现对微小“工件”的夹持、操控，而激光光刀则用作光学微刀具，实现对工件的显微加工，切割、消融、穿孔等。这样的系统构成了用光学夹具和刀具做成的全光学机器，是对生物微粒进行微操控和微加工的理想手段，飞秒光刀的应用最为广泛38。利用飞秒脉冲激光的多光子烧蚀效应，可以切除掉目的基因或组织后，再观察生物体没有这些细胞和组织后的机能变化，从而确定单个细胞或组织的功能39；光镊也可以用来挑选待融合的特定细胞，并把它们拖到一起相互接触，再用光刀作用于二者的接触面，诱发细胞融合，这种方法的融合产物具有高的纯度。此外，激光操纵细胞技术是当前最先进的转基因技术，利用光镊与光刀将DNA导入细胞而实

33、现基因转移，可大大提高成功率40。Seeger等人41利用光镊和光刀偶联已成功实现了染色体的精细切割和高效收集以及植物原生质的融合。 哈佛大学的Mazur 等人42-44使用飞秒激光与光镊相结合，从单个细胞器到多细胞组织这个范围内对生物样品进行了精确切除。光镊与高空间分辨率技术的结合光镊与具有高空间分辨率本领的技术结合，使之具备了更精细的结构分辨能力和动态操控能力，目前，国际上Coirauh. C等人45已成功地将原子力显微镜和光镊技术相结合，为研究生物分子提供了更准确、更可靠的方法。光镊与拉曼光谱的结合当一种频率的光照射到某种分子时被散射，散射光的频率不同于入射光的频率，这种现象称为拉曼散射

34、。拉曼散射产生的原因是分子转动能级和振动能级在外界光场作用下发生跃迁。拉曼散射光谱可提供样品分子结构的信息，而且具有无接触、非破坏、微量检测、快速、高精度等优点，在生物学领域得到了广泛的应用。激光光镊拉曼光谱系统就是将激光光镊与拉曼光谱相结合的一项光学技术，可以在接近自然的生理状态下研究单个生物细胞的识别及其构成成分的检测。通过调节激光强度，使光镊和拉曼光谱结合应用。如图15所示，当激光功率较小时，可被用作光镊，将生物微粒捕获在光束焦点处，与载玻片不接触，保持生物微粒的周围近似的天然微环境。当需要测量拉曼光谱时，瞬间增大激光功率，对所捕获的生物粒子的拉曼光谱进行测量。图15 光镊拉曼光谱系统光

35、路图46美国东卡罗莱纳大学物理系47成功地利用共焦拉曼光谱技术与光镊技术的结合技术，测量了单个细胞的拉曼光谱。光镊拉曼光谱系统近年来得到了非常广泛的应用。国内方面，吴智辉等人48利用激光光镊拉曼光谱系统，分别测定了健康者红细胞与心率失常患者及心肌梗塞患者红细胞的拉曼光谱，并进行了比较。梁裕芬等人49应用光镊拉曼光谱技术比较分析阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的拉曼吸收峰，寻找具有分类学鉴别价值的特征拉曼峰。中国科学院动物研究所王雁军等人50应用激光光镊喇曼光谱技术检测分离到单个胎肝干细胞和肝实质细胞，以及WB-F344大鼠肝干细胞系细胞，并比较了胎肝干细胞和肝实质细胞的喇曼光谱，结果表明激光光镊喇曼光谱

36、系统可以鉴别不同孕期的胎肝细胞和成体肝实质细胞，分析胎肝干细胞的分化机理，为临床应用肝干细胞治疗奠立基础。光镊与微流控芯片的结合在生命科学研究领域中，经常需要从混有多种不同类型和不同形态的细胞样品中分离出某种特定的细胞或细胞器。尤其是在研究微量样品时，由于样品的量少而珍贵，精确分选成为研究工作中的主要难题之一。现有的的分选技术大都效率比较低，且除了通过转基因技术使其转录绿色荧光蛋白等发光蛋白外，大多数情况下被分选后的细胞不能进行后续培养51。 随着光镊技术的发展，它对样品实现非接触的弹性控制、无机械损伤、可无菌操作的优势日益显著，而阵列光镊的发展更是突破传统光镊只能控制单个微粒的限制，实现在一

37、个平面上对多个细胞的捕获和分离，其灵活性、精确性和高效性备受瞩目；另一方面，随着微全分析系统的发展，微流控芯片技术在样品预处理、分离和检测等方面取得了质的飞跃，其分析的高效、多功能、微型化、低成本等优势，成为芯片实验室(Lab-on-a-Chip)的重要研究方面。因此，将多光镊系统与微流控芯片技术相结合，充分发挥各自优势而组成的微粒分选系统则成为进行少量细胞样品分选的最有希望的方法。Mirsaidov等人52通过将微流控系统与分时光镊结合，成功构建了人工合成组织。微流控系统用于将细胞导入组织装配区，分时光镊用于将细胞组装成为复杂的培养组织，之后细胞被包裹在模拟细胞外基质的可光聚合水凝胶中。光镊

38、技术在生命科学领域的应用光镊的发明使光的力学效应走向了实际应用，使人们对微粒进行主动地捕获并操控，光镊在捕获微小粒子、测量微小作用力及生产微小器件等许多方面都有非常重要的意义，而生物细胞的尺寸正好适合于光镊操控。对生物微粒的微操作固定、悬浮、分选自光镊问世，就被用来操控生物微粒，使得这些微粒能稳定地处在显微镜的视场中，稳定地停留在样品池中供研究者观察。1987年，A. Ashkin等54用光镊对病毒和细菌进行了捕获和操作实验，使其稳定悬浮在溶液中，且发现对其没有明显损害。燕山大学吕巍等人55在毛细管中对生物细胞进行了光微操纵实验，实现了光镊沿光束纵向和横向操作毛细管中的生物细胞。Min Gu等

39、人56利用大数值孔径的物镜对环形光束进行会聚，在玻璃-溶液界面发生全反射，不仅实现了对直径为2m 的微球的捕获，而且对红细胞进行了拉伸、折叠和旋转等操作。Murugan等人57利用微米级光纤光镊实现了对直径为10m 的聚苯乙烯微球的捕获。微米级光纤光镊是利用锥形光纤表面的倏逝场来实现对微粒的捕获和操纵。赵宇等人58把直径为125m 的普通单模光纤拉制成锥腰直径为2m 的锥形光纤，实验中发现当光纤通光时，在光纤锥区倏逝场的作用下，直径3m 的聚苯乙烯微球会保持平衡状态，并且光纤附近的微球被吸引到光纤表面，以5. 3m /s的速度沿着光束的传播方向运动。这个实验不仅实现了对微球的成功捕获，而且验证

40、了光纤光镊的力学作用。 光镊技术在生物医学领域的应用，仅限于体外的单分子和细胞研究。中国科大光学与光学工程系李银妹课题组与上海交大魏勋斌教授合作首次实现了光学捕获活体细胞，为活体研究和临床诊断提供了一种全新的技术手段59。研究人员用光镊穿过小鼠耳朵真皮层，到达深度约50微米毛细血管中，成功捕获和操控血管中的红细胞。课题组运用光镊技术，人为制造出了血管堵塞现象。针对血管中细胞团簇，课题组拖拽其中一个细胞引导疏通，使得血液流动恢复正常。分选：利用光镊，可以实现高选择性地分选微粒。由于不同种细胞的体积、质量、形状和折射率的不同，在三维光镊阵列中所受的力的大小和方向各不相同，分别形成不同的运动轨迹，从

41、而实现快速分流。英国St. Andrews大学的Dholakia等60设计了一种新型的微流体器件，利用外加光场和微流的作用，实现了两种不同微粒的分离实验，分离效率大95%，实验原理如下图16所示。B区中混合有红细胞和淋巴细胞两种微粒，在水流作用下流入分馏室。在没有外加光场时，B区中的两种细胞会全部流入D区。利用衍射分光元件产生同心非共面五光束干涉，在空间形成周期为微米量级的三维光点阵列，照射到分馏室上，由于两种细胞体积、质量、折射率等的差异，它们在三维光阱阵列受力的大小和方向也不同，所以在光场中的运动轨迹也不同。在外界光场和内部水流的作用下，分馏室中的红细胞和淋巴细胞实现了分离。图16 光致分

42、选技术实现微流体中两种细胞快速分离的实验原理图60 Grover等61使用两束相反方向的激光，在光捕获的基础上，通过图像处理系统区分红细胞、白细胞和血小板，并最终将分选好的各类细胞转运到微流系统的指定容器中。该分选方法快速、精准。Paterson等62利用Bessel光产生的环形对称光场将红细胞与淋巴细胞分开。在该研究中，研究者发现双凹行的红细胞在Bessel光的外环上聚集后才到达Bessel光中心，而球形的淋巴细胞则直接到达Bessel光中心。从细胞核中分离出特异性单条染色体一直是基因组学研究的重要课题。李银妹小组63首次提出用光镊和光刀及微吸管联合作用的光学微操作技术进行单条水稻染色体操控

43、，并从实验上实现了单条水稻染色体分选，所提取的单条染色体用于PCR扩增。由生物学鉴定实验成功提取了单条染色体，从而构建了单条水稻染色体文库。实验中，首先将水稻根尖组织分离成单个细胞，并使细胞沉降到样品池底，并对细胞中的染色体进行特异性染色。然后寻找合适的处于细胞分裂中期的细胞，使用激光光刀逐点击打细胞膜边缘直到细胞解体，从而使染色体从细胞内释放出来。如图17所示，利用光镊选择并捕获合适的染色体，并将其移出细胞残骸所在区域之外，如图18所示。最后使用微吸管将被光镊操控分选出来的染色体吸走，如图19所示。这样就完成了单条染色体的分离，使用光镊将单条染色体移开还有效地避免了细胞残骸的干扰。 图17

44、水稻根尖单个细胞在光刀作用下解体63紫外光照射下的100倍物镜下水稻根尖组织细胞的荧光图像，亮点处为染色体。细胞在激光光刀作用下解体，在某些染色体的凹陷处可以注意到着丝点的存在， 如箭头所示。图18 光镊分选水稻单条染色体63光镊捕获单条染色体，被固定在黑色十字框处；（b）（c）显示被捕获的染色体任然留在原处，而其他染色体碎屑随着载物台的移动而远离。图19 毛细微管吸收被挑选的染色体63被选出的染色体在微管尖端附近；光镊去掉后，气压降低的瞬间染色体被吸入微管中。研究生物微粒和组织结构的静态力学特性庄晓薇等人64用光镊技术成功解开了DNA分子的缠绕，对生物大分子的折叠、组装方式进行了深入研究。2

45、006 年Mihardja等人65利用光镊系统拉伸固定在小球上的单根核小体，详细地研究了DNA 双螺旋分子与组蛋白之间的相互作用。M. Manosas等人66通过光镊在小范围的作用力对RNA分子的伸展进行了研究。Chu等67利用100mW的光镊，用20m /s的速度拉紧单个荧光标记的DNA，然后释放一端使之随机松弛到原始螺旋结构，第一次观察到DNA聚合链的特征性运动，解释了许多生物材料的粘弹性行为。C. Bustmante等68成功用光镊操纵单个DNA，研究其非线性弹性拉伸应变的静力学特性。测量了其在0. 01-10pN范围内的拉伸性质。为研究单个DNA分子构型提供了进一步的实验基础。中科院物

46、理所郭红莲等69将光镊应用于细胞骨架力学性质的研究上，利用双光镊系统精确观测了细胞微丝的力学特性和微管断裂的动力学过程。研究生物微粒的动态力学特性在分子马达力学特性的研究上，1993年Block和Svoboda等人70在美国Rowland研究院把光镊与双光束干涉仪结合起来，在分子水平上第一次观测到驱动蛋白分子在微管轨道上阶梯式前进，步幅为8nm，时间间隔为毫秒量级，首次在实验上证明了驱动蛋白分子在把化学能转换为机械能的过程中是不连续的。图20 光镊研究 Kinesin 驱动蛋白在微管上行走72他们在实验中将驱动蛋白与被光镊捕获的硅球相结合，把微管固定在样品池底上，当驱动蛋白和微管相互作用时，硅

47、球在光镊的捕获下沿微管运动，通过观察硅球的运动轨迹，就可以得到驱动蛋白的运动状态，如图20所示。观察结果显示，驱动蛋白沿着微管的运动方式是离散的，而且步与步之间的时间间隔是随机的。之后的1997年，Schnitzer 等人71通过精确的实验进一步研究得到，驱动蛋白每走一步需通过水解一个 ATP 分子来提供消耗的能量。1999年，Block等人72又再一次通过实验得到了以下的结论：第一，kinesin分子运动时的负载能力具有很宽的范围；第二，具体负载的大小则由环境中的ATP分子浓度来决定；第三，分子负载越大运动的最大速度就会降低。在这一系列的实验中，光镊不仅被用作一个控制微粒的工具，而且具有了研

48、究微粒运动和受力的功能。通过改变光镊的激光功率，改变小球所受到的光阱力，从而改变kinesin分子运动时所承受的负载，还可以精确测量kinesin分子在运动时能承受的最大的负载力。Stanford研究中心73-74于1995年观测到肌球蛋白沿肌动蛋白丝是依序地以10nm的步距迈进而不是一大步跨越，并且还用激光陷阱测定了此微动力约为5pN。这一研究平息了人们多年来对肌球蛋白运动模式的争议，使得人类对生命中推动力的核心的认识迈进了一大步。单个分子运动试验引发了对运动详细模型、ATP水解环、单酶动力学的深人研究，使得光镊越来越成为一种研究分子动力结构的重要技术手段。Finer 等人75研究了肌球蛋白

49、和微丝之间的相互作用力和相对运动步幅。他们把两个聚苯乙烯小球分别粘在微丝的两端，然后利用负反馈双光镊系统捕获并移动这两个小球，把两个小球间的微丝绷直，肌球蛋白位于微丝下面黏在池底的硅小球上面。当肌球蛋白与微丝发生作用的时候，微丝会变形缩短，把聚苯乙烯小球拉离光阱，探测器就会探测出这个偏移，如图21所示。探测器给出的结果是肌球蛋白的运动步幅是11nm，微丝与肌球蛋白的相互作用力为3-4pN。此外，Wang 等人76也利用负反馈单光镊系统研究了 RNA 聚合酶以 DNA 为模板转录 RNA过程中的转录速度和作用力。图21 双光镊测量微丝与肌球蛋白间的相互作用75在蛋白质折叠与去折叠动力学过程的研究

50、上，Kellermayer 等人77测试了Titin肌肉蛋白分子的折叠和去折叠过程，Titin 肌肉蛋白分子在维持肌小节结构的完整性以及缓冲外力冲击时起着重要的作用。实验中，Titin 分子的两端分别粘接两个高分子小球，一个球用光镊捕获，另一个用微针固定，如图22所示。通过匀速移动微针使固定在光镊和微针间的Titin 分子的长度改变。用这样的方法就可以研究 titin 分子的长度的拉伸量与受力大小的关系。实验结果表明，Titin 分子的弹性性质并非线性，它在被折叠与去折叠的过程中表现出了不同的性质，导致了力的“磁滞”效应，如图22所示。另外，实验也表明了随着拉伸次数的增加，该“磁滞”效应也会逐

51、渐减弱。他们把 Titin 分子的两端分别粘在两个乳胶小球上，其中一个小球固定在玻璃底面，另外一个小球被光镊捕获。实验时改变两个小球间的相对位移，通过观测小球在光镊中的偏离位置，计算得到 Titin 分子伸缩与所受外力的关系。 图22 光镊和微针操控微球拉伸 titin 分子77此外 Cecconi78等人把单光镊与微吸管相结合，仔细研究了核糖核酸酶的折叠和去折叠的动力学过程。对生物大分子进行精细操作日本学者Y. Arai79等人用双光镊法把两端粘有聚苯乙烯小球的肌动蛋白微丝打结后拉紧，不断降低打结环的直径，当打结环的直径降低到 0. 36m 以下时，微丝断裂，如图23所示。通过测量聚苯乙烯小

52、球偏离光阱中心的位移可以得到微丝所受到的作用力，微丝断裂时所受到的力约为1pN。图23 双光镊对微丝进行打结，上方清晰的小图为示意图79微粒之间相互作用力测量沈为民、李银妹等人80已经建立了用光镊直接测量生物大分子间结合强度的方法，并结合脂酶体重重建技术对抗体与抗原的结合力进行了实验测量，在单分子水平上提供了一种可行的直接测量手段。该方法也已被推广到其他的生物大分子体系的力的测定中。为了研究NK细胞表面LFA-1分子的活化模式，陈昊东等81利用李银妹小组实验平台研究了LFA-1分子的行为。（自然杀伤（Natural Killer，NK）细胞是先天免疫系统第一道防线的一部分，其功能是由其表面多种

53、受体的综合作用实现的。淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）分子在促进NK细胞受体介导细胞杀伤过程中具有重要作用。）研究发现微球与细胞结合能力随二者接触时间的延长而增大，从约30pN增大到接近50pN。经分析，这可能是LFA-1分子发生招募聚集所致。该研究提供了一种可以监测活细胞在受到配体或抗体刺激前后受体分子行为的方法。 Yang等82使用光镊技术来测量凝血细胞之间的力，发现肝素使血细胞之间的力变小并延长凝血时间，而氨甲环酸使凝血过程直接进入最后阶段。纳米生物器件的组装光镊是目前对微米和亚微米尺度的微粒，进行非机械接触操控的唯一手段83。利用光镊逐个操控微粒，实现对微小粒子的排布，将生物细胞

54、或生物大分子按设定的方案排布成具有特定结构的聚集体，使其具有特定的功能，也为纳米生物器件的组装提供了一种可行方法。图24为光镊用2m聚苯乙烯小球排布形成的稳定的空间结构84。图24 用光镊实现聚苯乙烯小球的排布84与细胞性质相关的研究 应用光镊可以进行许多与细胞本身性质相关的研究，进而通过对比不同细胞特性将其加以区分，因此可以广泛应用于临床进行癌细胞等异变细胞的早期检测。1）对细胞应变能力的研究光镊是对活体细胞进行非侵入微观操纵的有利工具，能够诱导细胞产生应变。因为细胞内部的应变能力在通常情况下是很难用显微镜观察到的，单一的生理学或者形态学参数很难定义细胞的生存能力85。研究发现光镊发出的近红

55、外连续激光能够诱导线虫类C. elegans发生应变。根据C. elegans特殊的应变能力，发现在不同的激发波长、激发功率和照射时间内，C. elegans的应变也各不相同86。2）对细胞横向光阱力的研究光镊还被应用于研究细胞的横向光阱力87，目前的研究主要是针对红细胞。研究中以射线光学计算模型作为基础，运用类似于求解轴向力的方法，得出了横向光阱力的计算公式，进而对几何尺寸远大于光波长的米氏球状粒子所受激光微束横向光阱力进行了计算。结果表明，粒子只有在小于其本身半径的区域内才能被捕获，而不是在整个粒子半径区域，实验中还可以测量作用在粒子上力的大小和粒子的运动速度。实验还证明了微粒大小、相对折

56、射率等都会对光阱力产生一定的影响，适当选取各实验参数可增强捕获微粒的稳定性。3）对细胞表面电荷的研究西安交通大学张镇西等人88利用光镊装置结合电泳法较为准确地测量出细胞表面的电荷量。在电场力的作用下，处于悬浮液中的带电细胞产生电泳。在外加电场力为零时利用激光的陷阱力捕获该细胞，然后施加并逐渐加大外加电场力，直到细胞刚好逃脱光阱力的束缚时的瞬间光阱力，理论上就是细胞所带电荷在电场中产生的库仑力与粘滞力之和，由此可得出细胞表面的电荷量。 4）对细胞凋亡的检测南开大学张聿全等人89提出了一种基于动态光镊系统的细胞凋亡新型检测方法，并以女性常见的卵巢恶性肿瘤细胞为研究对象，研究了化疗药物（顺铂）4种不

57、同浓度下培养的卵巢癌SKOV3细胞的凋亡情况。实验结果表明该方法可以实现对癌细胞凋亡程度的无标记快速检测，凋亡程度可以通过光镊系统的捕获效率进行量化，因而具有较高的可靠性，可为临床检测提供重要指导意义。5)对细胞内物质的检测广西科学院的王巧贞等人92在群体细胞水平和单个酵母细胞水平上，应用光镊喇曼光谱技术对高浓度乙醇胁迫过程中细胞内生物大分子物质的动态变化进行实时监测。基于两种水平上的研究结果显示：在高浓度乙醇胁迫下，归属于核酸的喇曼峰、归属于蛋白质的喇曼峰和归属于脂类喇曼峰的峰强度都随处理时间的延长而显著降低，说明了高浓度乙醇诱导酵母凋亡过程中核酸、蛋白质、脂类等物质的含量是逐渐降低的。结合

58、单因素分析法与重复测量分析法发现，群体细胞与单个细胞光谱的变化有明显差异性，反映基于群体细胞的研究，个体细胞的信息被平均光谱信息所掩盖，无法体现个体间所存在的差异。应用激光镊子喇曼光谱技术基于单个细胞水平上的研究能更直接、真实地反映高浓度乙醇胁迫下细胞内生物大分子变化的动态信息。中国科学院动物研究所的王雁军等人93，应用激光光镊喇曼光谱技术检测分离到单个胎肝干细胞和肝实质细胞，以及WB-F344大鼠肝干细胞系细胞，并比较了胎肝干细胞和肝实质细胞的喇曼光谱。结果表明激光光镊喇曼光谱系统可以鉴别不同孕期的胎肝细胞和成体肝实质细胞，分析胎肝干细胞的分化机理，为临床应用肝干细胞治疗奠立基础。6)对细胞

59、分子层面化学变化的研究广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科的催向荣等人94比较3000Hz中频脉冲电磁场照射与无电磁照射后存活状态下的骨髓间充质干细胞拉曼光谱的差异，提示激光镊子拉曼光谱技术能够应用于单个干细胞分子层面生物化学变化的检测和研究。发现与未经电磁场照射组相比，经3 000 Hz中频脉冲电磁场照射后，骨髓间充质干细胞的拉曼光谱有明显差异，峰值普遍降低。光镊实验中如何连接生物样品光镊技术是研究细胞及生物微粒的理想研究手段，但是必须先对生物样品进行科学处理，然后再与光镊技术相结合，这也是使用光镊研究过程的关键问题。由于某些生物大分子的尺度太小，光镊刚度一般不足以稳定地捕获和操纵生物分子

60、本身，另外虽然光镊可以直接捕获小到数十纳米大小的微粒，但这样的微粒无法在光学显微镜下辨认，于是一种生物大分子的间接操控法发展起来，即采用光镊可以方便地操控的微米粒子作为所谓的“手柄”，将待测的生物样品通过表面修饰技术连接到“手柄”上，光镊操控这样的“手柄”就相当于操控了生物分子。常用的修饰方法有表面吸附法，化学（共价或二硫键）偶联法等90-92。图25 光镊对不同样品的实验方式90单光镊，大多数分子马达的行为都基于单光镊的探测，马达蛋白直接连接到光镊中的 聚苯乙烯珠小球上，和附着的微丝发生作用，马达蛋白的运动直接与小球运动相关单光镊微针/微管联用，样品另一端连到捕捉在微吸管里的另一个小球表面。