体外转录制备DNA模板

1、体外转录制备DNA模板，体外转录一、体外转录制备DNA模板具有平末端或5-突出末端的双链线性DNA可作为体外转录模板。线性化的质粒 DNA、PCR产物或cDNA只要含有双链RNA聚合酶启动子且方向正确均可用作转录模板。1、不同RNA聚合酶的同源启动子序列：T7:TAATACGACTCACTATA(+1)GGGT3:AATTAACCCTCACTAAA(+1)GGGSP6:ATTTAGGTGACACTATA(+1)GAAG(+1)是RNA转录的起始位点正义还是反义RNA转录产物的合成依赖于启动子的方向 (相对于目标序列)。正义RNA合成要求目标序列置于启动子的下游，而反义RNA的合成 则恰好相反。

2、2、质粒模板质量：质粒DNA的质量影响转录产量和合成RNA的完整性。最高纯度的质粒模板 可获最大的转录产量。常规实验方法纯化的DNA如果没有RNases、SDS、EDTA、蛋白 质、盐类*和RNA污染即可用作转录的模板。转录用DNA模板A260/280比值应在1.8- 2.0 之间。 GeneJETPlasmidMiniprepKit(#K0502) 可制备高纯度的转录用 DNA。*当NaCl或KCl的浓度超过150mM时，T7和SP6RNA聚合酶的活性50%被抑 制；当NaCl或KCl的浓度超过250mM时，T3RNA聚合酶的活性50%被抑制。线性化：如需获得特定长度的RNA转录产物，可在插

3、入位点下游选择合适的限制酶 (切割产生平末端或5-突出末端为佳)切割质粒DNA使之线性化。有报道指出3-突出末端 可能会引起错误转录(1),应尽量避免。3-突出末端可在转录前经T4DNA聚合(#EP0061) 处理平端化。抽提：由于RNA聚合酶具有很高的持续合成能力，环状质粒模板转录产生不同种类 长片段RNA转录子的产量比线性质粒模板高。因此质粒彻底线性化对确保有效合成特定长 度转录产物非常重要。如果不能彻底酶切，转录前可考虑凝胶回收（如 DNAGelExtraction Kit（#K0513）线性化DNA。线性化后，推荐酚/氯仿抽提纯化DNA模板：（1）加入1/10体积3M醋酸钠溶液（#R1

4、181）到DNA溶液中。（ 2）彻底混匀。（3）加入等体积酚/氯仿混合物（1:1 比例）抽提后再用等体积氯仿抽提两次。收集水相转移 至新离心管。（4）加入2倍体积乙醇沉淀DNA, -20C静置至少30分钟，离心收集沉淀。（5）弃上清，加入500170%冰乙醇漂洗沉淀。（6）加入 20|i1DEPC 处理水（#R0601）重悬 DNA。3、PCR模板：PCR产物可作为体外转录模板。RNA聚合酶启动子要求定位在待转录序列 的上游。二、常规体外转录采用以下操作方法可从lgDNA模板中制备10gRNA转录产物。反应体系可以放大 或缩小。如需高产量转录制备多达200昭 的RNA转录子，请选用Transc

5、riptAidT7High Yie1dTranscriptionKit（#K0441） 。解冻冻存的试剂，混匀后短暂离心。酶蛋白和核苷酸需冰上放置。反应缓冲液需室温放置。1、室温配制以下反应体系：ATP/GTP/CTP/UTPMix,10mMeach10|il(终浓度 2mM)线性化模板 DNA11gRiboLockRNaseInhibitor 1.2511(50u)T7 或 T3 或 SP6RNAPo1ymerase1.511(30u)DEPC 处理水 (#R0601)至 5011总体积 50112、37C孵育2小时。3、可选：加入 2M(2u)DNaseI,RNase -free(#EN0521)，混匀后 37C 孵育 15 分