dmpfc代谢组f15zqsqs2000常规组学分析报告

1、结题概要本项目采用先进的质谱仪 Xevo G2-XS QTOF (Waters，U.K.) 进行质谱，使用商业化Progenesis QI (Waters, U.K.)和研发的代谢组学分析流程对质谱数据进行深度分析，其中代谢物鉴定基于数据库HMDB ()，代谢通路分析基于数据库 KEGG()。项目样本分组信息如下表所示：表 1 项目信息本项目中，对所有离子鉴定和显著差异离子筛选情况的统计如下表（2 和 3）所示：表 2 总离子数鉴定结果正离子模式，指物质在离子源处进行离子化时的加合离子为H+，NH4+，K+等正离子；负离子模式，指物质在离子源处进行离子化的时的加合离子为COOH-，OH-等负离

2、子。指质谱数据下机后，经数据预处理后提取得到的所有离子总数。满足RSD30%的离子数，满足该条件的离子才会用于后续的统计分析。其中RSD 为相对标准偏差。一级数据指代谢物在离子源处加上 H+/NH4+/COOH-等加合离子后展现在质谱上的数据。一级鉴定数指使用一级数据通过搜索HMDB 数据库后被鉴定的数目。二级数据指一级数据在质谱仪中经过碎裂后，带有代谢物碎片离子的数据信息；二级鉴定数指利用二级数据通过搜索HMDB 数据库的理论二级碎片后被鉴定的数目。注：具有二级数据的代谢物肯定有一级数据，但是有一级数据的代谢物不一定有二级数据。所以在该表格中一级鉴定结果指没有二级鉴定的离子，二级鉴定结果指同

3、时具有一级鉴定和二级鉴定的离子，表格中一级鉴定结果和二级鉴定结果互不包含。表 3 显著差异离子筛选注：该表格包含三个组两两之间的差异离子，呈现了组间的差异离子上下调的大致情况。组间检测模式总数上调下调group2 vs group1正离子590315275负离子1014160group3 vs group正离子负离子11group3 vs group2正离子588258330负离子814140检测模式 1总离子数 2RSD30%的离子数 3一级鉴定数 4二级鉴定数 5正离子8109707934051983负离子533938621483863项目F15ZQSQS2000物种猕猴样本类型脑组织 d

4、mPFC 部位Control 组 (group1 组)5 个卧床组 (group2 组)5 个恢复期(group3 组)5 个目录结题概要I1 技术简介11.1 产品概述11.2 实验流程介绍11.2.1 代谢物提取11.2.2 LC-MS/MS 检测21.3 信息分析流程介绍32 标准生物信息分析结果32.1 原始数据查看（示例）32.2 数据预处理42.3 质控分析42.3.1 QC 样本TIC图52.3.2 QC 样本主成分分析52.4 统计分析62.4.1 单变量分析62.4.2 多变量分析82.5 差异离子筛选及鉴定82.5.1 组间差异离子的筛选82.6 聚类分析92.7 差异代谢

5、物通路分析113 数据分析方法说明143.1 峰提取及鉴定143.2 QC-RLSC143.3 主成分分析（PCA）143.4 聚类分析15附件一 试剂列表16附件二 设备仪器列表171 技术简介1.1 产品概述代谢组学全谱分析是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化关系的研究技术，其研究对象是相对分子质量小于1000 Da 的小分子物质，如脂类、酮类和有机酸等。众所周知，组学和蛋白质组学分别从和蛋白质层面探寻生命活动，但实际上细胞内许多生命活动是发生在代谢物层面的，如细胞信号、能量传递和细胞间通信等都受代谢物调控。本产品通过单变量及多变量统计分析发现显著差异的代谢物信息

6、，从而反映细胞所处的环境以及其与外界影响之间的相互作用关系。1.2 实验流程介绍10个QC样本10个随机检测样本1个QC样本10个随机检测样本1个QC样本10随机检测样本3个QC样本。图 1 实验步骤。1.用有机试剂沉淀蛋白法对样本进行代谢物提取，并同时质控（QC）样本；2.对所提取的样本进行上机检测，先用 10 个 QC 样本来平衡仪器（监测液相色谱-质谱检测过程中仪器的状态），接下来每上 10 个检测样本（随机）穿插一个 QC 样本，最后上三个 QC 样本结束实验。这里 QC 样本和检测样本穿插上机的设计可以评估样本数据质量。1.2.1 代谢物提取1) 取-80低温保存的组织样品，每个称取

7、 25mg；2) 取新的 EP 管放置于 EP 管架上（写上样品将称取好的样品导入EP 管中，并加入两颗小），加入 80ul 冷冻后的甲醇/水(1:1)的缓和溶液，；3) 将 TierLyser 的模式调至 60HZ，5min，然后开始研磨，离心，20000g，4 度，离心 10min。4)将 EP 管从离心机中取出，按顺序放置在离心管架上，取上清液 200ul，将上清进行真空冷冻，抽干，待用。液相色谱-质谱检测代谢物提取液对照组样本质控样本处理组样本1.2.2 LC-MS/MS 检测1.2.2.1 检测仪器液相色谱：2777C UPLC system (Waters，U.K.)质谱：SYNA

8、PT G2 XS QTOF (Waters，U.K.)1.2.2.2 液相参数色谱柱参数： ACQUITY UPLC BEH C18 (100mm*2.1mm，1.7m)（Waters，U.K.）；相A: 水相B：乙腈；梯度洗脱程序: 02min，100%A-100%A；212min，100%A-0%A；1214min，0%A-0%A，；1415min，0%-100%A；流速：0.4 mL/min；进样体积 10L。1.2.2.3 质谱参数质谱参数设置如表 4 所示，离子源气体使用（99%）氮气。表 4质谱检测参数离子源参数其他参数Sling cone:40 VTOF acquisition

9、mode:Sensitivity(-)Desolvation temperature:500 CTOF mass range:50-1200 DaSource offset:80Collienergy function 2:Trap CE r20 to 40 eVSc:0.1 sDesolvation/Cone gas:800/50(L/h)Acquisition methodContinuum MSESource temperature:120 CIonization mode：ESI+/ESI-Capillary:0.25 kV(+)/2kV(-)1.3 信息分析流程介绍图 2 信息分析流

10、程。首先对质谱下机原始数据进行预处理，提取峰列表信息，并进行数据校正；其次，通过一系列的统计分析找出不同处理条件下差异表达的代谢物；最后，对代谢物及差异代谢物进行鉴定，并进行 Pathway 分析。2 标准生物信息分析结果2.1 原始数据查看（示例）质谱下机原始数据，经Masslynx（Ver过 MZmine 打开浏览。4.1 Waters，U.K.）转换为 CDF 格式数据，可通图 3 总离子流图图 3 示例样本的总离子流图（TIC, 即以时间点为横坐标，以每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后为纵坐标得到的图谱）2.2 数据预处理质谱下机原始数据导入商业Progenesis QI (ver

11、2.1，以下简称 QI) 进行峰提取，获得代谢物相关的质荷比、保留时间和离子面积等信息。接下来对提取出来的数据进行去低质量离子，以及采用QC-RLSC（Quality controlbased robust LOESS signal correction）方法校正。对校正后的数据进行过滤，即将所有 QC 样品中相对标准偏差（RSD） 30%的离子过滤掉（RSD30%的离子在实验过程中波动较大，不纳入下游统计学分析）。最后得到的离子统计信息如下：表 5 离子数目统计1QC 样本中相对标准偏差（RSD）小于等于 30%的离子数占总离子数的比例峰提取结果文件：F15ZQSQS2000_dmPFC /

12、 Peak_picking/Measuement_neg.csvF15ZQSQS20000 _dmPFC / Peak_picking/Measuement_.csv2.3 质控分析QC 样本在样本检测前用于平衡“色谱-质谱”系统，在样本检测过程中用于评价液质系统的稳定性。检测模式离子总数RSD30%的离子数比例正离子.29%负离子5339386272.33%2.3.1 QC 样本 TIC图图 4-1 正离子QC 样本TIC图图 4-2 负离子QC 样本TIC图图 4 QC 样本的 TIC图(TIC 即总离子流图，是以时间点为横坐便，以每个时间点质谱图中所有离子的强度加和为纵坐标得到的图谱),

13、 QC 样本为同一个样本的重复，它们TIC 的越高说明仪器越稳定。图可以用于初步判断仪器状态，程度2.3.2 QC 样本主成分分析正离子模式负离子模式图 5 QC 样本主成分得分图。X 轴表示第一个主成分，Y 轴表示第二个主成分。括号里的数字表示该主成分能综合原始信息的比例。绿色点为检测样本，蓝色点为质控样本。质控样本 QC 可以相对在一起，得越好表明仪器越稳定，的数据质量越好。正离子模式下 QC 样本主成分得分图：F15ZQSQS2000_dmPFC /PCA/ loess_all_RSD_0_30_PC1_PC2_负离子模式下 QC 样本主成分得分图：.pngF15ZQSQS2000_dm

14、PFC /PCA/ loess_all_RSD_0_30_PC1_PC2_neg.png2.4 统计分析代谢组学分析的主要目的是从检测到的大量代谢物中筛选出具有统计学和生物学意义的代谢物，并以此为基础阐明生物体的代谢过程。由于代谢组学数据具有“、海量”的特点，因此需要用单维和的方法根据数据特性从不同角度进行分析。华大代谢组学研究团队开发的代谢组学数据分析流程，可进行单变量和多变量分析，从而获得组间差异代谢物；其方法包括参数检验和非参数检验、差异表达倍数分析、主成分分析（PCA）等。2.4.1 单变量分析代谢组学数据分析中常用 Wilcoxon 秩和检验（或者 T 检验、方差分析（ANOVA）等

15、）和变异倍数分析等单变量分析方法对数据所反映的数量变动进行分析。该项目中，采用的是 t 检验和变异倍数分析（Fold changeysis，FCysis）。在统计分析过程中，最终结果以 txt 表格和火山图（Volcano plot）形式呈现差异倍数（Fold change）和 p-value 两个指标，通常以差异倍数1.2 或1.2 或者 0.8 ；2） p-value 0.05，两者取交集，得到共有的离子即差异离子。差异离子鉴定采用的是 Progenesis QI (ver2.1)， 差异离子及鉴定结果如下表：表 6 差异离子鉴定组间检测差异离一级 二级上调(一下调(一上调(二下调(二模式

16、子总数鉴定 鉴定级鉴定)级鉴定)级鉴定)级鉴定)group2 vs group1正离子590355211负离子101663928381722group3 vs正离子92502428221113正离子模式下差异离子统计结果： F15ZQSQS2000_dmPFC /Differential/1_2_mz_fc_vip_ F15ZQSQS2000_dmPFC /Differential/1_3_mz_fc_vip_ F15ZQSQS2000_dmPFC /Differential/2_3_mz_fc_vip_负离子模式下差异离子统计结果：.txt.txt.txtF15ZQSQS2000_dmPFC

17、 /Differential/1_2_mz_fc_vip_neg.txt F15ZQSQS2000_dmPFC /Differential/1_3_mz_fc_vip_neg.txtF15ZQSQS2000_dmPFC /Differential/2_3_mz_fc_vip_neg.txt2.6 聚类分析对筛选出来的差异离子做聚类分析，用热图形式呈现如下：group1_2group1_3group负离子5group3 vs group2正离子588329119负离子81402515251213group2_3正离子模式聚类分析group1 2group1_3group2_3负离子模式聚类分析图

18、 8 聚类分析热图。图中的每一行代表一个差异离子，每一列代表一个样本，不同颜色表示不同的强度，颜色从蓝色到红色，表示强度从低到高。正离子模式 heatmap 图：F15ZQSQS2000_dmPFC / Cluster/ 1_2_heatmap_正离子模式 heatmap 图：F15ZQSQS2000_dmPFC / Cluster/ 1_3_heatmap_正离子模式 heatmap 图：F15ZQSQS2000_dmPFC / Cluster/ 2_3_heatmap_.png.png.png负离子模式 heatmap 图：F15ZQSQS2000_dmPFC / Cluster/ 1_2

19、_heatmap_neg.png负离子模式 heatmap 图：F15ZQSQS2000_dmPFC / Cluster/ 1_3_heatmap_neg.png负离子模式 heatmap 图：F15ZQSQS2000_dmPFC / Cluster/ 2_3_heatmap_neg.png2.7 差异代谢物通路分析代谢通路分析能够帮助了解代谢物所参与的主要生化代谢途径和信号转导通路，本项目基于KEGG数据库进行代谢物代谢通路分析。表 7 正离子模式group1_2 差异离子的代谢通路表 8 正离子模式group1_3 差异离子的代谢通路表 9正离子模式group2_3 差异离子的代谢通路#P

20、athwayCountPathway ID1Metabolic pathways64ko01100#PathwayCountPathway ID1Metabolic pathways12ko011002Purine metabolism6ko002303Valine, leucine and isoleucine degradation3ko002804Protein digestion and absorption2ko049745Gap junction2ko045406Parkinsons disease2ko050127ABC transporters2ko020108Salivary

21、 secretion2ko049709Mineral absorption2ko0497810Lysine biosynthesis2ko00300#PathwayCountPathway ID1Metabolic pathways64ko011002Drug metabolism - cytochrome P45016ko009823Steroid hormone biosynthesis11ko001404Protein digestion and absorption10ko049745Neuroactive ligand-receptoreraction8ko040806Tryptop

22、han metabolism8ko003807Tyrosine metabolism7ko003508Pyrimidine metabolism6ko002409Bile secretion6ko0497610Arachidonic acid metabolism6ko00590表 10 负离子模式group1_2 差异离子的代谢通路表 11 负离子模式group1_3 差异离子的代谢通路#PathwayCountPathway ID1Metabolic pathways10ko011002Phenylalanine metabolism5ko003603Amino sugar and nuc

23、leotide sugar metabolism2ko005204Histidine metabolism2ko003405Galactose metabolism2ko000526Phenylalanine,tyrosineandtryptophan2ko00400 biosynthesis7Pentose and glucuronateerconvers2ko000408Ascorbate and aldarate metabolism2ko000539Thiamine metabolism1ko00730#PathwayCountPathway ID1Metabolic pathways

24、21ko011002Linoleic acid metabolism7ko005913ABC transporters5ko020104Alanine, aspare and glutamate metabolism4ko002505Arginine and proline metabolism4ko003306Phenylalanine metabolism4ko003607Lysine degradation4ko003108D-Arginine and D-ornithine metabolism4ko004729Cysteine and methionine metabolism4ko

25、0027010Protein digestion and absorption3ko049742Drug metabolism - cytochrome P45010ko009823Protein digestion and absorption9ko049744Neuroactive ligand-receptoreraction8ko040805Arginine and proline metabolism8ko003306Purine metabolism7ko002307Tryptophan metabolism7ko003808Lysine degradation7ko003109A

26、rachidonic acid metabolism7ko0059010Bile secretion6ko04976表 12负离子模式group2_3 差异离子的代谢通路注：表 7 为差异代谢物的代谢通路注释的前 10 行。Pathway 表示代谢通路名称，Count 表示在这个代谢通路中的代谢物个数，Pathway ID 为代谢通路。正离子模式代谢通路分析：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_1_2_diff_identi_information htm正离子模式代谢通路分析：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_1_3_diff_ident

27、i_information htm正离子模式代谢通路分析：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_2_3_diff_identi_information htm正离子鉴定信息：F15ZQSQS2000_dmPFCPathwaydiff_ 1_2_diff_identi_information_filtering xls正离子鉴定信息：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_ 1_3_diff_identi_information_filtering xls正离子鉴定信息：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_ 2_3_diff

28、_identi_information_filtering xls负离子模式代谢通路分析：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_neg1_2_diff_identi_information.htm负离子模式代谢通路分析：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_neg2_3_diff_identi_information.htm负离子鉴定信息：F15ZQSQS2000_dmPFC Pathwaydiff_neg 1_2_diff_identi_information_filtering.xls负离子鉴定信息：F15ZQSQS2000_dmPFC Pa

29、thwaydiff_neg 2_3_diff_identi_information_filtering.xls3 数据分析方法说明3.1 峰提取及鉴定峰提取及鉴定主要通过商业Progenesis QI (ver2.1) 实现，包括峰对齐、峰提取、归一化、去卷积和加和离子鉴定等步骤。峰提取和鉴定的主要参数设置如表 8 所示。表 8 Progenesis QI 主要参数#PathwayCountPathway ID1Metabolic pathways35ko011002ABC transporters9ko020103Protein digestion and absorption8ko0497

30、44Arginine and proline metabolism8ko003305Aminoacyl-tRNA biosynthesis7ko009706Alanine, aspare and glutamate metabolism6ko002507Purine metabolism5ko002308Phenylalanine metabolism5ko003609beta-Alanine metabolism5ko0041010Butanoate metabolism5ko0065010Protein digestion and absorption1ko04974模式加和离子峰对齐峰提取参数归一化3.2 QC-RLSC基于 QC 样本信息对检测样本信号进行局部多项式回归拟合信号校正（Quality