临床基因诊断

1、临床基因诊断临床基因诊断PCR与基因诊断技术基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。PCR与基因诊断技术基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断基因诊断基因蛋白质性状生化诊断基因诊断临床诊断

2、方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄生虫的形态速度慢，灵敏度低，对经验水平要求高费时费工，无法辨别形态相近的寄生虫体外培养、接种能检测到活的寄生虫，并可检测感染性和感染程度速度慢、花费高，寄生虫可能难以进行体外培养，且必须使用动物材料抗体检测简单、快速、能够实现自动化，可用于检测大量的样品无法区分活的寄生虫与处在潜伏状态的寄生虫。有时会有非特异反应发生DNA杂交及PCR快速灵敏，能够实现自动化，可以分辨不同种的寄生虫，不需要以前有寄生虫感染病史花费高，步骤多，无法区分活的和死的寄生虫，有时会有假阳性或假阴性 检测寄生虫感染的诊断方法的比较方法优点缺点显微镜镜检简单易行，可直接观察到寄

3、生虫的形态速度基因诊断的特点特异性高检测目标是基因，为原始的致病因素灵敏度高待测标本往往微量，目的基因只需pg水平稳定性高基因的化学组成为核酸，比蛋白质稳定，且不需处于活性状态诊断范围广，适应性强确切的诊断，也能确定与疾病的关联状态临床应用前景好基因诊断的特点特异性高基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制显著提早产前诊断的时间无需对组织、器官或细胞进行选择快捷准确、安全基因诊断优点从基因水平彻底揭示疾病的病因及发病机制基因诊断常用的技术核酸分子杂交PCR（聚合酶链式反应）限制性酶切分析SSCP（单链构象多态性分析）DNA 测序 DNA 芯片技术基因诊断常用的技术核酸分子杂交DNA

4、Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCPRNA Northern blot, RT-PCR, micoarraysProtein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray DNA基因诊断的原理利用分子生物学和分子遗传学的技术，从DNA或RNA水平检测、分析基因的存在、变异和表达状态，从而对疾病做出诊断的方法策略检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因检测与某种遗传标志连锁的的致病基因检测表型克隆基因基因诊断的原理利用分子生物学

5、和分子遗传学的技术，从DNA或R感染性疾病的诊断 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定分子诊断的临床应用感染性疾病的诊断 分子诊断的临床应用一、感染性疾病的诊断利用PCR技术或PCR与分子杂交标记相结合，可以快速准确地检测出病原性物质。一、感染性疾病的诊断疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫抽取血样进行镜检 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体 无法区分是以前感染还是现在感染DNA杂交诊断例一：疟疾的分子诊断：检测是否存在疟原虫例一：PCR检测针对疟原虫特有的一段188bp的DNA序列设计引物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的条带PCR检测原位PCR(in situ PCR,ISP

6、CR )在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩增，并通过原位杂交进行检测不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细胞中定位原位PCR(in situ PCR,ISPCR )二、遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测二、遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia)典型的单基因遗传性疾病 血红蛋白的链（珠蛋白）的第六个氨基酸Glu发生突变成Val镰刀形细胞贫血症(sickle-cell anemia)典型血红蛋白 -链上 谷氨酸变成缬氨酸血红蛋白 -链上 谷氨酸变成缬氨酸 英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗

7、传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。 血友病基 因 英国女王维多利亚。她带有血友病基因，并将其传给三、法医学应用DNA指纹每个人体细胞内都含有23对染色体，每条染色体中部含有一个DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含着遗传信息，在DNA分子中存在三种类型：单拷贝序列、中等程度重复序列、高度重复序三、法医学应用DNA指纹每个

8、重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所以也称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星DNA” “小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA “中有一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNA进行分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指纹” 通过对人类基因组的解析，发现人与人之间9999的碱基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自于双亲，据此可用于“亲子鉴定”每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重

9、复，序列经过滴骨验亲法： 以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。 三国时代（公园220280年）谢承著会稽先贤传中的以弟血滴兄骨可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。滴骨验亲法： 以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨合血法： 等到了明代，更是采用了“合血法”来识别亲权。明末清初的检验书籍中都有相同的记载：“亲子兄弟或自幼分离，欲相认识。难辨真伪

10、。命各刺出血，滴一器内，真则共凝为一，否则不凝也。”合血法： 等到了明代，更是采用了“合血法”来方法：DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有特征性的DNA分子杂交图谱最常用的DNA探针是微卫星序列受害者血样犯罪嫌疑人衣物上血样犯罪嫌疑人血样方法：DNA指纹是指对待测样品中的DNA进行分析所得到的具有临床基因诊断 在细胞内核酸代谢的异常: 肿瘤细胞和正常细胞的核酸代谢有显著的不同； 不同类型肿瘤细胞的核酸代谢也有较大的差异； 相同恶性程度肿瘤细胞的核酸代谢也有所不同。 肿瘤是一种分子病三、基因诊断与肿瘤 在细胞内核酸代谢的异常:肿瘤是一种分子病三、基因诊断与肿瘤 癌基因的激活 抑

11、癌基因的失活（或缺失） 肿瘤发生机理 癌基因的激活肿瘤发生机理原癌基因癌基因病毒癌基因 肿瘤抑制基因 肿瘤转移相关基因 肿瘤耐药基因等肿瘤相关基因原癌基因肿瘤相关基因细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因 癌基因在正常细胞的基因组中 存在 不表达状态 表达水平不足以引起细胞的恶性转化癌基因：细胞基因组中具有能够使正常细胞发生恶性转化的基因癌基因：能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常 增殖的基因 目前研究较多的有p53基因、pRB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。 抑癌基因能够抑制细胞恶性转化或抑制细胞异常抑癌基因包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制 基因。肿瘤转移相关基因包括肿瘤转

12、移促进基因或肿瘤转移抑制肿瘤转移相关基因其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。 肿瘤耐药基因其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的基因。 肿瘤耐药基因 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：肿瘤转移标志物肿瘤抗药基因突变的癌基因肿瘤相关的病毒基因 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断目前主要集中在以下几个方面：肿瘤基因的分子诊断意义 1.肿瘤的早期诊断和筛选2.肿瘤疗效监测 3.肿瘤的预后判断 4.肿瘤微转移检测 肿瘤基因的分子诊断意义 1.肿瘤的早期诊断和筛选 美国前副总统汉弗莱Humphrey)在1967年发现膀胱内有一肿物，病理切片未发现癌细胞 良性“慢性增生性囊肿”，未进行手术治疗。九年后，他被诊断为患有“膀胧癌”，两年后死于该病。 美国前副总统汉弗莱Humphrey)九年后 1994年，研究者用灵敏的PCR技术对上述汉弗莱1967年的病理切片进行了P53抑癌基因检查