07其它实验补充常用方法总结

1、一、Takara ExTaq 体系组成： TakaraExTaq （5U/UL） dNTPMixture：:：:：:54一、Takara ExTaq 体系组成： TakaraExTaq （5U/UL） dNTPMixture：:：:：:541.05UL 步骤：灭菌蒸馏水10*EXTaqBuffer正向引物反向引物dNTP ： ； DNA放到-20（11%琼脂糖凝胶（50UL 用称量纸片（抽屉里）0.4g 的琼脂粉（； 40ML1*10TBST100ml 的三角烧瓶里；倒入琼脂粉摇匀，并转到微波炉中加热（50S,加锡箔纸封盖）溶解完全；用手套取出到凉水稍稍晾凉至温热后，加入核酸酶（Eb 替代物）

2、2ul；要边加边条带的一方，方便加样20min；MARKloadingbuffer6ULloading buffer；MARK MARK1000*/loadingbuffe+KBR将已跑出条带的凝胶转至切胶机上（手套垫着； 3DNA回收(DNA纯化回收试剂盒，离心柱型)8100bp DNA （80%收率 3DNA回收(DNA纯化回收试剂盒，离心柱型)8100bp DNA （80%收率 BL（BLPW（PWCB2，收集管（2ML）试剂置于室温（1525）28保存更长，若有沉淀则室温或者放置 CB2中（吸附柱放入收集管中）500UL BL， 12000rmp1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重

3、新放回收集管中（洗；DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的PC（0.1g100UL）50水浴放置 将吸附柱放回收集管中，12000rmp/2min离心，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于将吸附柱放入一个干净的离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱液 （ 一般用蒸馏水 ddw）30UL，室温放置 12000rpm/2minDNA（为了提高回收量可重新再离一次）保存-20DNA 降解。pMD18-T 是一种高效克隆 PCR 产物载体，它是由pUC18 载体在Xba I 和Sal 识别位点间 EcoR V 位点，然后用 EcoR V 进行酶切使质粒线性化，并在它的 3端添加“T”

4、构建而成。因其 3端带有一个突出的“ T”尾，能高效地与带“ A”尾 PCR 产物连接，极大地提高了克隆的效率。TA 克隆是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。ddw, T 载体离心后放入冰盒中ddw1ULPCR 管中,T载体，最后加入目的基DNA10min；TA 克隆技术（TA cloning）利用 Taq 聚合酶具有末端转移酶（TdT）3-5PCR 3A3kb LB3kb LB 50100UL 5ml 提质粒：(小提CP3 500ULBL，12000rpm 1min.倒掉收集管中 P1（250 UL P26-8350ul的溶液P36-8次，充分混匀，此时将出现将上一步收集的上清液用移

5、液枪转移到吸附柱 CP3 中，注意尽量不要吸出沉淀， CP3 500UL PD，12000rpm/1min,倒掉废液，CP3 放回收集CP3 600UL PW(检查是否加入无水乙醇)，12000rpm/1min, 倒掉废液，CP35min.将 CP3 放入一个新的 EP 管中，向吸附膜的中间部位滴加 ddw,室温放置DNA （10ulDNA （10ul酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用（） 3 . 1. 1.5mLg限制性内切酶：1L（10U 2. 3371-3h7010min（37/3h）10*HXT4 连接 （16/10*T4DNALigase 0.

6、30.03To25T4 连接 （16/10*T4DNALigase 0.30.03To25NEB 10*T4DNALigaseInsent0.06To20T4DNA0.02T4DNA1. 1.5mLg1：1L（10U2：1L（10 2. 3371-3h7010minDNA 原理 ：材（一）（4、-20、-70）倒 （三 ss1. 从-80冰箱/3990s令880g(rcf3； 5.标好细胞种类/日期/37培养箱静置培养；细胞贴壁后次日更换一次摇匀时注意顺时针/1058090%（细胞间隙狭窄）时，必须传代；3PBS 2 遍（；8090%（细胞间隙狭窄）时，必须传代；3PBS 2 遍（；（37/C

7、O2 293/1min 管中，880G/3min 离心（一般细胞）NB4 880rpm/5min；100ML；10%DMSO；20%。2（67滴、6cm12滴、10CM 24滴 2；6冻存：可放入冻存盒，然后放到-80冰箱；（冻存盒中含有异丙醇，可以程序自1/1min）;/ 2h ，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。430min 后转到-20/30min 冰箱,最后转到-80（冻细胞种板， 34冰箱中拿出今天要种板细胞的试剂：PBS EDTA ） 2（、6细胞种板， 34冰箱中拿出今天要种板细胞的试剂：PBS EDTA ） 2（、6EDTA（676cm1224滴一步消化（H

8、uh7 5min，293T/1min） 管中，880G/3min 离心； 样品 1MLN/M(ML匀细胞悬液)62ML 完全培养基（5005ML双抗（PS）（FBS）500ML基础培养基BCA10.05g EP 完全培养基（5005ML双抗（PS）（FBS）500ML基础培养基BCA10.05g EP 2RIPA裂解液（含PMSF蛋白酶抑制剂）400l/ PMSF ：nesulfonyl（二6（2 =1%30min（100200 rpm/s）;EP管中；（4/5min/12000rpmBCA BCAA:B=50:1（24h保存稳定1l（320l=1样本+19PBS稀释液；200lBCA 工作液

9、，3730min（温箱保存； uffer 1/20 g/l（WB 20l/孔 RIPA ：Radio 将蛋白酶抑制剂（1.52l）与细胞裂解液(150200 l)按 1%的比例加入到 1.5ml EP 中,轻弹混匀后放入冰盒中（蛋白酶抑制剂和细胞裂解液均要在冰6 孔板要加混合液，100200l/孔、 将蛋白酶抑制剂（1.52l）与细胞裂解液(150200 l)按 1%的比例加入到 1.5ml EP 中,轻弹混匀后放入冰盒中（蛋白酶抑制剂和细胞裂解液均要在冰6 孔板要加混合液，100200l/孔、150250l /6CM 板； 冻存-80western blod(取用时，9510min500 转

10、标准蛋01248终浓度0ECL、一抗、二抗、双蒸馏水、盒、镊子、pH（10%ECL、一抗、二抗、双蒸馏水、盒、镊子、pH（10%膜、孵育盒（一、二抗孵育、封闭盒、洗膜盒、10%SDS： 称取 10gSDS 100ml（避免反复冻融分装保存- uffer4 -51Bromophenolblue（溴酚蓝110*Running：1441030.2210与Southern 或Northern 杂交方法类似，但WesternBlot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样Westernbolt: 是将蛋白质转移1*Running（

11、回收10010*Running10*TransferBuffer 451441*TransferBuffer （1L）100800（pH ：801*Running（回收10010*Running10*TransferBuffer 451441*TransferBuffer （1L）100800（pH ：80301*TBST （1L）2.520%900封闭液配制 50ml 脱脂奶粉用50 2.51525ml，现配现用（80rpm1h直接用封闭BSA50ml 2.5gBSA50mlTBST 溶解（-20保存一抗（1:8000）50 5%的BSA 至新的0.625l一抗原液（anti-GAPDH）,

12、颠倒混匀。1（看底部是否持平，防止漏胶，可加入适当的水2（TEMED，因加入后胶开始凝固15ML 离心管内，混匀后，灌胶。330%丙烯酰胺混合液 1.5ml Tris（pH8.8） % 75%压胶，30min （10018ml（约210030.2900430%丙烯酰胺混合液 1.5ml Tris（pH6.8） 10APS 10SDS430%丙烯酰胺混合液 1.5ml Tris（pH6.8） 10APS 10SDS TEMD（颠倒混匀51ML 的 75%乙醇（作用压平胶及消灭气泡6、 胶板倒尽乙醇后，灌入浓缩胶，加好以后插上梳子静置 30min(否则浓缩胶7（细流慢滴，再包入保鲜膜中，4冰箱长期

13、保存（当取出时要用自来水冲洗。：BCA 10.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mgBSA）中，充分溶解后配25mg/ml 的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，可长期保存-20。225mg/ml 蛋白标准，稀释至终浓度为 0.5mg/ml（例如取 20l 25mg/ml980l0.5mg/ml蛋白标准。稀释0.9%NaCl PBS）0.5mg/ml 蛋白标准-20长期保存。3根据样品数量，按50 体积BCA 试剂A 1 体积BCA 试剂B（50:1）配制适量 5.1ml BCA 24h 稳定）4、 将标准品按 0、1、2、4、8、12、16、20l 加到 96 孔板的标准孔中，加标准2

14、0（23 排，以减少操作误差）l；5（1l）96 60/30min (一) 提蛋白（冰 将蛋白酶抑制剂（1.52l）与细胞裂解液(150200 l)按 1%的比例加入到 1.5ml EP 中,轻弹混匀后放入冰盒中（蛋白酶抑制剂和细胞裂解液均要在冰6 孔板要加混合液，100200l/孔、150250l /6CM 板； 冻存-80western blod(取用时，9510min500 转（一）； 冻存-80western blod(取用时，9510min500 转（一）1.52*105PBS洗所获取2 次；30l （二取出蛋白，9510min/500rpm变性（恒温金属浴）; 5000rpm/3m

15、in 离心（不可瞬离，速度太快）;20l 1l 1l Marker22.5l Marker做好标记，加第一孔样品时位置坐低点方便加入；100V/0.5h（Marker8条带都出现后，所有蛋白样品压； 当最小的Marker PVDF 膜先用甲醇活化，且不能用手触碰到膜上，否则会造成膜的污染，MARK 完全蛋白和MARK部分的面要面向PVDFMARK 完全蛋白和MARK部分的面要面向PVDF按照白板海绵三层滤纸PVDF），确保胶在负极，PVDF 膜在正极，放入冰盒4Transfer Buffer，盖盖时要正负放对（红配 100V/1.5h 110V/1h（根据蛋白大小而定；配黑）4（封闭前，膜易被

16、污染，操作时务必需要谨慎） PIN114KD 处切一刀（切出，4过夜；15ml23h4 二抗孵育完成后，TBST3 ：ECLA、B 0.40.5ml,放入二抗孵育完成后，TBST3 ：ECLA、B 0.40.5ml,放入在电脑桌面上打开“image Lab”程序；300s/10张将机身上方滤光片横杆打到“no filter” marker的位置的步骤 PH计快速指南（FE胶浓度分离范围6%PAGE 分离胶成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L胶浓度分离范围6%PAGE 分离胶成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L10%过硫酸 10%PAGE

17、分离胶成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L10%过硫酸成所需各成分的体积凝胶体5 10%PAGE 分离胶成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L10%过硫酸成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L10%过硫酸成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L10%过硫酸成所需各成分的体积凝胶体5成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L10%过硫酸成所需各成分的体积凝胶体5蒸馏30%丙烯酰胺混合1.5mol/L10%过硫酸Westernbolt 洗脱液的配方4保存Tris-HCL(PH一、具体配方二、具体操作步骤1将用 TBST 洗过的条带后放入加有洗脱液的试管中水浴