CIMT促进脑缺血大鼠神经功能康复的分子机制的研究课件

1、强制性运动疗法促进脑缺血大鼠神经功能康复分子机制的研究张 璇济宁市第一人民医院前 言脑梗死 ( cerebral infarction) 是一种发病率、死亡率和致残率均较高的疾病，给家庭和社会带来了巨大的经济和精神负担。虽然超早期溶栓治疗效果好 ，但大部分病人受时间窗限制而失去了溶栓时机 ，神经功能缺失不可避免，总会遗留不同程度的神经功能障碍，如偏瘫、失语等。由于神经系统具有很强的可塑性，后期的神经功能康复显得非常重要。 强制性运动疗法 （congstraint-induced movement therapy CIMT）是以中枢神经系统可塑性为基础，发展起来的一种康复治疗技术。 CIMT的基

2、本概念是在生活环境中通过限制患者使用健侧肢体，达到强制反复使用和强化训练患肢为目的的疗法。神经影像学研究及临床应用研究均显示CIMT有显著促进神经功能康复的作用。但其确切的作用机制还不十分清晰。立题目的和意义探讨CIMT促进脑缺血大鼠神经功能康复的分子机制 ，从而为临床该疗法的广泛应用推广提供理论指导。材料与方法1材料1.1实验动物 120只SD大鼠，体重（26050）g，雌雄不拘，实验期间定期检测大鼠心率、血压、呼吸并维持于正常范围。大鼠术前12h禁食，自由饮水。1.3 动物模型制备：大鼠自体血栓栓塞大脑中动脉局灶脑缺血模型的制备，选用SD大鼠，体重230350g, 用大鼠自体血制成直径为0

3、.35mm的血栓，切成1.52mm长，用麻醉导管将58个栓子注入一侧颈内动脉，使其堵塞大脑中动脉起始部，建立大脑中动脉闭塞局灶脑缺血模型。假手术组只分离血管不注入血栓1.4 强制性使用运动疗法干预80只脑缺血模型成功大鼠，1W时给予进行神经功能缺损评分，随机分2组（即对照组和CIMT组），CIMT组大鼠用 10%水合氯醛麻醉，将健康的一侧前肢置于自然屈曲位置，用手术缝线将皮肤缝在一段3 厘米长的铁丝上（铁丝尾端与绕在胸部的铁环相连），然后用石膏缠绕固定该肢体，部分限制其肢体活动，固定后仍饲养于原笼中。手术后第 8W解除固定。 1.5.1 石蜡切片制备：每组在1W、2W、4W、8W各时间点，分别

4、随机取2只大鼠，局部麻醉后经2.5%的戊二醛固定后，断头取脑。用锋利刀于病灶边缘取脑组织（各标本取材部位大致相同），0.51mm3的3小块。经再固定、梯度酒精脱水、丙酮、环氧丙烷、环氧树脂包埋后，进行超薄切片。1.5.2 电镜超薄切片制备： 每组在1W、2W、4W、8W各时间点，分别随机取2只大鼠，局部麻醉后经2.5%的戊二醛固定后，断头取脑。用锋利刀片于病灶边缘取脑组织（各标本取材部位大致相同）0.51mm3的3小块。经戊二醛再固定、梯度酒精脱水、丙酮、环氧丙烷浸透、环氧树脂包埋后，进行超薄切片1.5.3 免疫印迹脑组织取材每组在1W、2W、4W、8W各时间点，分别随机取3只大鼠，局部麻醉后

5、经以 4生理盐水进行灌洗，断头取脑，迅速取缺血侧大脑皮层及缺血灶边缘各200mg 脑组织备用2.1 神经功能缺损评分 每组在1W、2W、4W、8W各时间点进行神经功能缺损评分，参照改良的Bederson氏6级评分标准 进行评分。2.2 电镜观察超微结构变化2.3.1原位杂交及免疫组化结果观察原位杂交及免疫组化结果，经常规染色、封片后，自然晾干，结果在40倍物镜下观察每张切片阳性细胞表达，经td2000图像处理系统分析处理，采集图像输入计算机，,以灰度计算所选视野阳性染色的单位面积(阳性细胞的的面积占所选整个视野面积的百分比),每张切片取梗死灶边缘区互不重叠的5个视野，其均值即为该标本每个高倍镜

6、视野中阳性细胞的单位面积。2.3.2免疫印迹结果分析采用2200 凝胶图像分析仪，于可见光下采集底片上的蛋白条带图像，通过与相应 -actin 条带密度比较，计算每个条带密度相对值。2.4 统计学方法 数据采用均数标准差（s）表示，运用spss10.0 统计学软件包分析，采用单因素方差分析oneWayANOVY方法统计，其中两两比较采用Student-Newman-keuls方法，显著性水平为0.05。3.结 果 结果 3.1 CIMT对大鼠脑缺血后神经功能缺损的影响大鼠脑缺血模型术后7d，CIMT组和对照组Bederson评分比较无显著性差异(P0.05),与假手术组比较，差异明显（P0.0

7、1）。随着时间的延长，两组神经功能缺损症状都逐渐减轻。CIMT神经功能改善较对照组显著(P0.01)。3.2超微结构观察结果超微结构观察 缺血1W时对照组缺血边缘区大量胶质细胞和神经元受损，细胞内外水肿，核膜结构破坏，核内异染色质增多、聚集，毛细血管、轴突水肿，线粒体肿胀，突触解体，数目减少。残存突触结构肿胀明显，突触前膜、突触间隙和突触后膜特化带结构模糊，分界不清，在突触前成分内散在分布结构不完整的囊泡，突触连接带明显变短，突触间隙变窄; 随着时间的延长，在2W、4W、8W时上述病理改变逐渐减轻，突触数量有所增加，可见新生突触，4W时超微结构CIMT组超微结构观察CIMT组经治疗在第2W、4

8、W、8W观察时发现其缺血边缘区突触结构损伤程度较对照组明显减轻，突触数目减少较对照组少，新生突触明显增多，见图10。随着时间的延长，这种效果愈加明显。4W时超微结构CIMT对NgR mRNA表达的影响 CIMT对NgR 蛋白表达的影响 CIMT对NgR mRNA及蛋白表达的影响与假手术组比较，在第一周对照组及CIMT缺血灶边缘脑组织及同侧皮质中NgR mRNA及蛋白表达明显增多。随着缺血时间延长，对照组及CIMT缺血灶边缘脑组织及同侧皮质中NgR mRNA及蛋白表达逐渐减少。与对照组比较，CIMT组缺血灶边缘脑组织及同侧皮质中NgR mRNA及蛋白表达减少程度更显著（0.01）。CIMT对BD

9、NF mRNA及蛋白表达的影响 CIMT对BDNF mRNA表达的影响 CIMT对BDNF 蛋白表达的影响 与假手术组比较，在第一周对照组及CIMT缺血灶边缘脑组织及同侧皮质中BDNF mRNA及蛋白表达明显增多。随着缺血时间延长，对照组缺血灶边缘脑组织及同侧皮质中BDNFmRNA及蛋白表达逐渐减少，而CIMT在观察点第2W、4W时（即治疗1W、3W后）其缺血灶边缘脑组织及同侧皮质中BDNF mRNA及蛋白表达较观察点第1W时明显增加，观察点第8W时逐渐下降，但与对照组比较有显著变化见表3（0.01）。CIMT对GAP-43 mRNA表达的影响 各组大鼠脑组织在4W时GAP-43的表达 假手术组 对照组 CIMT组CIMT对GAP-43 蛋白表达的影响 CIMT对SYPmRNA表达的影响 各组大鼠脑组织在4W时SYP的表达 假手术组 对照组CIMT组 结 论1、强制性使用运动疗法可明显降低脑缺血大鼠神经功能缺损程度，减低脑梗塞的致残率2、强制性使用运动疗法通过降低NgR的表达，促进脑源性神经生长因子BDNF的表达，减少对神经再生的阻滞，促进神经轴突发芽、建立侧枝反射，促进神经修复。3、强制性使用运动疗法通过促进大鼠脑梗死后缺血边缘区及大脑皮层GAP43和SYP的表达，具有促进神经生长、突触再生和重建、完善突触效能的作用，促进神经修复。结 语通过本课