D-1-1分离纯化概论食品分析课件

1、蛋白质分离与表征生物大分子物质的制备：分离纯化方法：沉淀法；电泳法；色谱法（离子， 凝胶，亲和，反相，疏水，气相，高效液相）；纯化鉴定方法：电泳，反相，质谱， 氨基酸序列的测定。生物分子定量测定方法：Folin酚法对纯化生物分子的表征： 主要内容生物大分子物质：指动物、植物和微生物进行新陈代谢时所产生的蛋白质和核酸等有机化合物。蛋白质（酶）、核酸存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能；核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋白质的合成。生物大分子物质：是生物科学工作者研究的重要对象，而且与化

2、学、医学和食品等工业部门紧密联系。特别在科研和医学方面，要探讨结构与功能、防治疾病时，常常需要纯的和比较纯的生物大分子物质。而这些物质却往往与自然界存在的成百上千种不同化合物结合在一起，或者自身之间相互结合在一起的。一、分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。 而这些物质却往往与自然界存在的成百上千种不同化合物结合在一起，或者自身之间相互结合在一起的。要获得纯的或比较纯的物质，必须分离纯化。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需

3、要：如用猪胰岛素治疗糖尿病，抗体（免疫球蛋白）的应用。蛋白质工程与基因工程的需要。三、分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： 材料的选择和预处理 破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离） 分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。第一节 材料的获得 材料的选择原则 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。 实践过程全面考虑，综合平衡：如胰岛素（选猪不选牛）科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。如提取磷酸单酯酶：在胰脏、肝脏和脾脏中含量

4、丰富，但其与磷酸二酯酶共存，很难分开；所以选用前列腺（单酯酶少，但没有二酯酶）材料的选择原则A 原核细胞表达大肠杆菌表达载体：目前较常用的是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25以上。融合蛋白：GST融合蛋白，选择大肠杆菌偏爱的密码子，容易表达外源蛋白。融合蛋白往往有利于表达和纯化。用途：制备蛋白、抗体，生化性质研究，结构研究。 优点：操作简单，产量高，成本低。缺点：表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。培养条件：根据不同研究目的，选择培养条件。 生化性质研究和结晶需要有活性的可溶性蛋白，需要选择培养条件

5、如低温，降低表达速度，添加辅助因子，改变宿主菌等。优点：表达产物经过正确修饰，一般具有天然活性。缺点：操作比较复杂，表达量较低，成本较高。第二节 测定方法的确立一、目的与要求目的：是否存在，含量多少，是否有活性；要求： 简单、灵敏、花时间少； 方法专一性要强。1.光谱法2.电化学法3.色谱法4.生物活性测定法5.免疫分析法6.生物传感器等法二、常用的测定方法1.光谱法吸收光谱法：如一种酶反应的底物或产物有一个明显的吸收光谱时，借助发色团的产生和消失可确定酶存在的数量。荧光法：利用物质反应中发荧光而进行的荧光测定。 精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。比浊度法：利用悬浮液的反应前后浊度的变化而

6、测得的消光值。适用比较稀的悬浮液。2. 电化学法pH计法：如反应过程中释放出氢，可用灵敏的pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出待测物的含量或活力。电导滴定法：如葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH作为滴定剂滴定该酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。3. 色谱法以标准对照，比较出峰位置出峰时间、峰高和峰面积等，判断待测物的存在和含量。5. 免疫分析法采用抗体与抗原之间发生的特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，对有关物质（抗原、抗体）进行灵敏 的定性和定量测定。6. 生物传感器法采用生物传感器中的敏感膜与待测溶液中的某一物质进行反应，可通过显示器反映出有效成分

7、的量。二、细胞的破碎分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实

8、际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压、冻融或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。三、细胞器的分离细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心。常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。细

9、胞器的分离方法破碎细胞动物，植物细胞：匀浆，研磨，超声大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶细胞器的分离：差速离心法四、提取组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含生物大分子被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。1、蛋白质（酶）的提取大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或 Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中

10、非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸。常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。抽提注意点： 1. pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白在此pH条件下稳定。一般缓液浓度为2050mM。 2.温度：低温如410。 3.离子强度：如0.10.2 M NaCl或KCl. 4.其他成分：还原剂如NaHSO4，维生素C；巯基保护剂DTT，巯基乙醇；金属螯合剂EDTA，EGTA；蛋白酶抑制剂PMSF。第四节 纯化方案的设计与评价一、纯化方案的设计目标：快速得到纯化的样品；设计：各种纯化方法 首先选用粗放、快速、有利于缩

11、小样品体积和后序出来的方法； 然后选用精确、费时间和需样品量少的方法。 忌同一种方法重复使用。二、纯化方案的评价目标：得到活力高、回收率高的纯化样品；评价原则：凡是纯化倍数高，回收率高的纯化方案，科学合理；不可能100，因物而异。二、纯化方案的评价评价方法： 对纯化过程的每一步收集的溶液都进行有效成分的含量测定； 测定比活力：活力单位数/毫克蛋白 纯化倍数：每步的比活力/ 粗提液的比活力； 回收率（得率）：每步的总活力/ 粗提液的总活力。第五节 分离纯化概述从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。分离纯化的方法

12、很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 性质 方法分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀电荷 电泳、离子交换层析吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）对配体分子 亲和层析 的生物亲和力分离纯化原理主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。1、粗分级分离（1）盐析向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4)2SO4/Na2SO4，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。盐析

13、作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析法。 透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在蒸馏水中进行，可不断更换蒸馏水，直至杂质被除去。透析袋蛋白质溶液蒸馏水（2）等电点沉淀蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净

14、电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。（3）有机溶剂法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：降低水的介电常数，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋

15、白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。2、细分级分离一般样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的柱层析及电泳方法。常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。Details to be talked ！3、酶的活力测定在酶的制备过程中，每一步骤都应测定留用以及准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。总活力=活力单位/ml酶液总体积（ml）比活力=总活力单位数/总蛋白（氮）