酶促反应动力学实验教案

1、文档编码 : CT6K3F2H2L6 HH8W5B6W3U6 ZQ3V9G7V6R3生 物 化 学 实 验（上）试验一 酶促反应动力学试验底物浓度对酶活性的影响 pH 对酶活性的影响温度对酶活性的影响华中科技高校生命科学与技术学院20XX级生物化学小老师 第一组酶促反应动力学综合试验试验（一）碱性磷酸酶【试验目的】1.明白底物浓度对酶促反应速率的影响Km 值的测定2.把握米氏方程、Km 值的物理意义及双倒数作图求Km 的方法；【试验原理】1.米氏方程：1 式中： v 表示酶促反应速率,表示酶促反应最大速率,S表示底物浓度,Km 表示米氏常数；v=Vmax S/ （Km+S ,这个方程称为Mic

2、haelis-Menten 方程,是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的,其中 Km 值称为米氏常数, Vmax 是酶被底物饱和时的反应速度,S为底物浓度；由此可见 Km 值的物理意义为反应速度 v 达到 1/2Vmax 时的底物浓度（即Km=S ）,单位一般为 mol/L ,只由酶的性质准备,而与酶的浓度无关；可用 Km 的值鉴别不同的酶； 当底物浓度特殊大时,反应速度接近于一个恒定值；在曲线的这个区域,酶几乎被底物饱和,反应相对于底物S 是个零级反应；就是说再增加底物对反应速度没有什么影响；反应速度逐步趋近的恒定值称为最大反应速度 Vmax ；米氏常数 Km 是酶促反应速度 v 为最大酶

3、促反应速度值一半时的底物浓度；这可通过用 S取代米氏方程中的 Km 证明,通过运算可得 v=Vmax /2 ；2. Km 值的测定主要接受图解法,有四种：双曲线作图法（图a）1/2时的底物浓度 s值即为 Km 值,以克分子浓度依据公式（ 1）,以 v 对s作图,此时（M ）表示；这种方法实际上很少接受,由于在试验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和；实测一个近似值, 因而 1/2不精确； 此外由于 v 对S的关系呈双曲线,试验数据要求较多,且不易绘制； Lineweaver- Burk 作图法双倒数作图法（图 b）实际工作中,常将米氏方程（式（1）作数学变换,使之成为直线形式,测定要便利、精确得多

4、；其中之一即取（1）式的倒数,变换为Lineweaver- Burk 方程式：2 以1 对 .1作图,即为y=ax+b 形式；此时斜率为,纵截距为；把直线外推与横轴相S交,其截距即为；Hofstee 作图法（图略 ,不要求）把（ 2）式等号两边乘以 Vmax,得：3 以 v 对作图,这时斜率为,纵截距为,横截距为；Hanas 作图法（图略,不要求）把（ 2）式等号两边乘以 S, 得：4 以 v 对作图,这时斜率为,纵截距为；（a）b Km 值；具体原理如本试验主要以双倒数法,即 Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶下：本试验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其作用物,碱性磷酸

5、酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸,在适宜条件下,精确反应15 分钟；在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长 660nm 比色；在确定条件下色泽深浅与光密度成正比；反应式如下：然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度（摸索分析这样处理的原理及合理性）,即以光密度的倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐标,按 Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 Km 值；【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴锅；2. 721 型分光光度计；3. 试管；4. 吸量管；5. 移液枪；6. 烧杯；试剂：1. 酚试剂2. 2.5mM 磷酸苯二钠基质液3. 碱性缓冲液（ pH10.0 ）4. 碱

6、性磷酸酶【留意事项】1. 加入碱性磷酸酶的量要精确,并且 提前进行预热 ；2. 保温时间要精确,不同试管加热时间须保持一样 ,留意计时方法；3、磷酸苯二钠为 2.5mmol/L ,留意与后两个试验区分；4、使用分光光度计和移液枪时留意操作步骤；【试验步骤】取 6 支试管按下表加入试剂：0 号管切勿加酶！2 3 4 5 0 1 2.5mM 磷酸苯二钠（ mL ）1.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ mL ）0.2 0.8 0.6 0.4 0.2 - 碱性缓冲液 （pH10.0）（mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀后, 37预温 5 分钟；留意：反应碱性

7、磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到 37,再滴加到试管中参与碱性磷酸酶液（mL ）- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混匀后, 37水浴 15 分钟（精确计时）；留意： 1）加入碱性磷酸酶液要快速、精确；（用移液枪加）2）酶促反应溶液 总体积 2.2mL ；3）第 0 管不加酶,基本无反应；酚试剂（ mL ）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na 2CO3 mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀后, 37水浴 15 分钟（精确计时）；留意： 1）酚试剂为显色剂,同时为酶的变性剂,故加入酚试剂后酶促反应停止；以 0 号管调零,在2）Na2CO3 供

8、应碱性环境,加入 Na2CO 3后试剂才显色, 37水浴使显色充分；660nm 波特长比色；【结果处理】1将各管光密度和底物浓度记入下表: 2 3 4 5 管号1 O.D1 O.D2 O.D3 O.D（均值）1/O.D S 请自行运算 1/S 2以 1/O.D 为纵坐标, 1/s为横坐标,按Lineweaver- Burk 作图,求出碱性磷酸酶的Km值,并分析试验结果；【试验目的】试验（二）PH对酶活性的影响明白 PH 对酶活性及酶促反应速度的影响,加深对酶特性的熟识；【试验原理】大部分酶活力受其环境 pH 的影响；在确定的 pH 下,酶反应具有最大速度,高于或低于此值,反应速度下降,通常称此

9、 pH 值为酶反应的最适 pH；不同的酶具有不同的最适 pH；【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴锅；2. 试管和试管架；3. 移液枪及枪头；4. 721 型分光光度计；5. 移液管；试剂：1、0.01M 磷酸苯二钠；2、碱性磷酸酶液（pH=10）；3、不同 pH 缓冲液；4、酚试剂和 10% Na 2CO 3 溶液；【留意事项】1、碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热 达到 37,再滴加到试管中参与反应2、留意磷酸苯二钠为 0.01mmol/L ,与试验一不同【试验步骤】取六支干净试管,编号后按表操作：管号0 1 2 3 4 5 0.01M 磷酸苯二钠 （mL）0.3 0.3 0.3 0.3 0

10、.3 0.3 缓冲溶液蒸馏水pH 9 pH 10 pH 11 pH 12 pH 12 1.2mL1.0mL 1.0mL1.0mL1.0mL1.0mL混匀,置于37水浴 5min；留意：碱性磷酸酶溶液应先置于水浴锅中预热到 37, 再滴加到试管中参与反应碱性磷酸酶液（mL）- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混匀,再置于 37水浴 15min；酚试剂（ mL）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na 2CO3 mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀后,置于 37水浴中再次保温 15min,然后以第 0 管调零点,用 660nm 波长比色；以各管 pH

11、 为横坐标, 光密度为纵坐标绘制曲线,从曲线上可大致得出碱性磷酸酶的最适 pH；【结果处理】记录现象（或比较吸光度值）分析；,以 pH 为横坐标、吸光度为纵坐标制图,依据图象做出合理试验（三）温度对酶活性的影响【试验目的】明白温度对酶活性及酶促反应速率的影响,加深对酶特性的熟识；【试验原理】每种酶都有其最适温度,高于或低于此温度酶的活性都降低；一般而言, 如酶处于过高的 温度环境中, 会使酶活性永久丢失；而如处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制,一 旦温度适宜,酶又会全部或部分的复原其活性；【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴锅；2. 试管和试管架；3. 移液枪及枪头；4. 721 型分光光

12、度计；5. 移液管；试剂：1碱性缓冲液：同试验一中碱性缓冲液配制（pH=10 ）；20.01M 磷酸苯二钠；3酚试剂；4碱性磷酸酶液；510% Na 2CO 3 溶液；【留意事项】1. 加入碱性磷酸酶的量要精确；2. 保温时间要精确,留意计时方法；3. 将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸钠溶液,马上摇匀之后在室温下 放置 15min；【留意事项】1. 加入碱性磷酸酶的量要精确,并且提前放入不同温度水浴锅中进行 预热 ；2. 对反应温度的把握要严格,不同温度下反应的时间必需保证 一样 ,建议每隔一分钟向装有底物的试管中加入酶液,便于用秒表计时；3. 将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸

13、钠溶液,马上摇匀之后在 室温下放置 15min； 4、留意磷酸苯二钠为0.01mmol/L ,与试验一不同【试验步骤】取 6 支干净试管,参照下表加入试剂：0.01M 磷酸苯二钠（ mL）0 1 2 3 4 5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 碱性缓冲液（ mL ）1.2 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀后,将 05 管分别置于室温、 37、50、60、70和 80中水浴 5min ；留意：碱性磷酸酶溶液应先放于不同水浴锅中预热,再滴加到试管中参与反应碱性磷酸酶液（mL）- 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 混匀后,连续原温度水浴加热15min（精确计时）；酚

14、试剂（ mL ）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 10%Na 2CO 3mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀后,室温放置15min 后,以第 0 管调零,用660nm 波长比色；再以温度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制曲线；从曲线上可得出此试验条件下碱性磷酸酶的最适温度；【结果处理】记录现象（或比较吸光度值）分析【摸索题】,以温度为横坐标、吸光度为纵坐标制图,依据图象做出合理1.反应时间 15min 是经过试验得出的较好结果,试分析时间长了或短了会有何影响 .2.回答试验原理中括号中的摸索题3.其次个试验中两次水浴的目的分别是什么,去掉其中一个行不行,为何？附

15、录 仪器操作规范与留意事项移液枪使用留意事项：1. 不使用时,请竖直放置；2. 枪头为一次性,可多次吸取同一种液体,不行吸取不同液体；3. 吸液时,拇指向下压到有阻力,然后轻轻释放（确定不能松开拇指）体因惯性冲入移液管；,防止液4. 吸液时,枪头内不能有气泡；规范操作： 取移液枪调至所需加液用量,套上枪头, 大拇指摁下按钮到刚有阻力时将枪头伸入液体中,轻轻吸上液体,放出液体时按钮按到底即可；移液管使用留意事项：1. 使用前必需清洗干净,用吸水纸将尖端内外的水除去,然后用待吸溶液洗三 次,洗的时候,吸取液体约占管身的三分之一,将移液管润洗即可；洗过的 溶液应从流液口放出弃之；2. 吸取溶液时,管

16、尖应深化液面10-20mm,并随液面下降而下降,用洗耳球在移液管另一侧将液体吸入管中, （切忌用嘴吸）吸液时,手应 慢慢放松洗耳球 ,防止让移液管内液体上升太快导致液体冲入洗耳球中；另外不要让液面升得太高,使管壁沾附过多的液体,以免在调定液面和排液时流下来,影响容量的精确度；3. 调定液面或放液时吸管均应 垂直放置 ,其流液口与容器内壁相接触,接受容器须倾斜 30 ,移液管者始终保持垂直；为保证液体完全流出,要 等待约 3秒钟 ,方可拿开；4 . 吸管内的溶液按规定方法排出后,移液管尖嘴的残留液, 假如移液管上 没有标明“ 吹” 的字样 ,不能排到接受容器中,如有,就用洗耳球将剩余液体吹 入；

17、注：当吸取有毒或腐蚀性液体,可选用有安全泡的吸管,并使用吸具（如洗 耳球等）操作 移液管规范操作：使用移液管前,先看移液管上的标记,刻度线位置,检查管头是否损坏；润洗时,先慢慢吸入移液管长度的1/3 左右,将移液管横置,并转动移液管使溶液接触到刻度线以上的部分,进行润洗；随后将溶液由管下口弃去,并用洗耳球吹去残余液体；反复润洗三次；分光光度计使用步骤一.预热使用前插上插头；打开开关,预热 20min；二.选定波长三调零：1.将黑色比色皿和参比液放入培养皿内,并将黑色培养皿拉入光路,按模式键调至 T,按 0%键将透光率调为 0；2.拉动伸缩杆,将参比液拉入光路,按 100%键,将透光率调为 10

18、0；3.再按模式键调至 A 模式,显示屏显示 0.00 即可；四样品测定将待测样品拉入光路,显示屏上的示数即为光密度值；保持光路中的样品不变,打开盖子,再将盖子盖上,就再次读出光密度值,重复测量三次,取其平均值,即为该样品的光密度值；五试验完毕清理仪器,将比色皿洗干净,用滤纸吸干,再用擦镜纸顺一个方向擦干,放入盒子内；最终关闭电源,拔掉插头；留意事项：1. 预热和不测定时应将暗箱盖打开,以延长光电管寿命2. 测定系列溶液时,应从稀到浓的次序3. 读数应在 0.1-1.0 间. 4. 留意调零校准；5. 留意如分光计示数不稳固, 马上检查比色皿是否干净, 波长是否为 660nm；使用比色皿留意事项：1. 比色皿应轻拿轻放,以免